Просмотр кода страницы Морфолиновые олигонуклеотиды

[[Файл:MorpholinoHeteroduplex.png|thumb|right|280px|Фрагмент гетеродуплекса морфолинового олигонуклеотида и РНК]]
'''Морфоли́новые олигонуклеоти́ды'''{{sfn|Аппель и др.|2013|с=206}}<ref>{{статья |заглавие=Модификации и аналоги нуклеиновых кислот: инструменты современной молекулярной биологии |автор=П. В. Золотухин, Ю. А. Лебедева, О. Н. Кузьминова, Е. К. Брюханова. |ссылка=http://journal.valeo.sfedu.ru/journal/201302.pdf#page=27 |issn=2218-2268 |издание=Валеология |номер=2 |год=2013 |страницы=27—33 |archivedate=2016-03-05 |archiveurl=https://web.archive.org/web/20160305001851/http://journal.valeo.sfedu.ru/journal/201302.pdf#page=27 }}</ref><ref>{{статья |автор=Н. М. Белоногова |заглавие=«Прямая» и «обратная» генетика. Генетика количественных признаков |ссылка=http://vavilov.elpub.ru/index.php/jour/article/view/236/238 |издание=Вавиловский журнал генетики и селекции |год=2014 |том=18 |номер=1 |страницы=147—157}}</ref>, или '''морфоли́новые олигоме́ры'''<ref>{{статья |автор=Т. В. Абрамова, В. Н. Сильников. |заглавие=Синтез и свойства модифицированных по углеводофосфатному остову аналогов олигонуклеотидов и миметиков нуклеиновых кислот |издание=Усп. хим. |год=2011 |том=80 |номер=5 |страницы=452—476 |ссылка=http://m.mathnet.ru/php/archive.phtml?wshow=paper&jrnid=rcr&paperid=55&option_lang=rus}}</ref> ({{lang-en|morpholino, morpholino oligomer, phosphorodiamidate morpholino oligomer, PMO}}) — [[Синтез|синтетические]] [[олигонуклеотид]]ы, использующиеся в [[Молекулярная биология|молекулярной биологии]] для изменения [[Экспрессия генов|экспрессии генов]]. Основу молекулярной структуры морфолинового олигонуклеотида составляют метилен[[морфолин]]овые кольца и [[Амидофосфаты|фосфородиамидатные]] [[Химическая связь|связи]]. Морфолиновые олигонуклеотиды блокируют доступ других [[Молекула|молекул]] к небольшим (длиной около 25 [[нуклеотид]]ов) специфическим последовательностям за счёт [[Комплементарность (биология)|комплементарного]] [[Спаренные основания|спаривания]] с соответствующей [[РНК]]. Морфолиновые олигонуклеотиды служат исследовательскими инструментами в [[Обратная генетика|обратной генетикe]] для [[Нокдаун гена|нокдауна гена]]. 

Нокдаун гена заключается в предотвращении синтеза [[Клетка (биология)|клеткой]] соответствующего [[Белок|белка]]<ref name="RNaseH">{{cite pmid|10807004}}</ref>. Морфолиновые олигонуклеотиды также могут влиять на [[сплайсинг]] пре-[[мРНК]]<ref name="Draper">{{cite pmid|11477696}}</ref>. Нокдаун гена является мощным средством для изучения функции конкретного [[ген]]а. Аналогичным образом, вырезание специфического [[экзон]]а из [[Транскрипция (биология)|транскрипта]] позволяет определить функции, выполняемые соответствующими [[Аминокислоты|аминокислотными]] [[Остаток (биохимия)|остатками]] белка, а иногда приводит к полной инактивации белка. Морфолиновые олигонуклеотиды используются в изучении многих [[Модельные организмы|модельных организмов]], в том числе [[Мыши|мышей]], [[данио-рерио]], [[Лягушки|лягушек]] и [[Морские ежи|морских ежей]]<ref>{{cite pmid|11884031}}</ref>.

Разрабатываются пути применения морфолиновых олигонуклеотидов в [[Медицина|медицине]] против [[патоген]]ных [[организм]]ов ([[Бактерии|бактерий]]<ref>{{cite pmid|15844617}}</ref> и [[вирус]]ов<ref name="Deas">{{cite pmid|17485503}}</ref>), а также для ослабления проявления [[Генетические заболевания|генетических заболеваний]]<ref name="McClorey">{{cite pmid|16919955}}</ref>.

== Структура ==
Морфолиновые олигонуклеотиды — это синтетические молекулы, представляющие собой измененные нуклеиновые кислоты<ref name="SummertonWeller">{{cite pmid|9212909}}</ref>. Они, как правило, имеют длину 25 нуклеотидов и комплементарно связываются с соответствующими последовательностями РНК за счёт спаривания [[Азотистые основания|оснований]]. Морфолиновые олигонуклеотиды имеют обычные азотистые основания, которые вместо [[Дезоксирибоза|дезоксирибозы]] соединены с кольцами [[Морфолин|морфолина]], а в связи отдельных нуклеотидов участвуют не [[фосфат]]ные, а фосфородиамидатные группы. Замена отрицательно заряженных фосфатных групп незаряженной фосфородиамидатной группой устраняет [[Ионизация|ионизацию]] при [[Физиологические условия|физиологических значениях]] [[Водородный показатель|рН]], так что в живых клетках эти молекулы не заряжены. Вся молекула морфолинового олигонуклеотида состоит из таких изменённых нуклеотидов<ref name="SummertonWeller" />.

== Функции ==
{{кратное изображение
| зона           = right
| направление    = vertical
| заголовок      = Механизмы действия морфолиновых олигонуклеотидов
| зона_заголовка = 
| подпись        = 
| зона_подписи   = 
| ширина         = 240
| изобр1         = Gene Expression.gif
| подпись1       = Нормальная экспрессия гена
| изобр2 = Blocking_Translation.png
| подпись2 = Трансляция заблокирована морфолиновым олигонуклеотидом
| изобр3 = Blocking_Splicing.png
| подпись3 = Сплайсинг заблокирован морфолиновым олигонуклеотидом
}}
Морфолиновые олигонуклеотиды не вызывают деградации своей РНК-мишени, в отличие от многих антисмысловых молекул (например, [[Малые интерферирующие РНК|малых интерферирующих РНК]] и {{нп5|Тиофосфаты|фосфоротиоатов|en|Thiophosphate}}). Вместо этого они выступают в роли «пространственных блокаторов», связываясь с последовательностью-мишенью и физически не давая другим молекулам связаться с этой РНК<ref name="RNaseH" />. Морфолиновые олигонуклеотиды часто используются для изучения роли специфических мРНК в развивающемся зародыше. [[Эмбриолог]]и инъецируют их в яйца или зародыши данио-рерио<ref>{{cite pmid|11017081}}</ref>, [[Шпорцевая лягушка|шпорцевой лягушки]]<ref>{{cite pmid|10885751}}</ref>, морских ежей<ref>{{cite pmid|11152635}}</ref> и [[рыбы]] ''[[Fundulus heteroclitus]]'' или доставляют эти молекулы путём [[Электропорация|электропорации]] в зародыши [[Курица|курицы]] на более поздних стадиях развития<ref>{{cite pmid|11262245}}</ref>; обработанные таким образом зародыши называют ''морфантами''. При наличии в [[Цитозоль|цитозоле]] правильных систем доставки морфолиновых олигонуклеотидов могут быть эффективными и в [[Культура клеток|культурах клеток]]<ref name="Morcos">{{cite pmid|11477682}}</ref><ref name="Summerton">{{cite pmid|16394126}}</ref>.

=== Блокирование трансляции ===
Связываясь с [[5'-нетранслируемая область|5'-нетранслируемой областью]] мРНК, морфолиновые олигонуклеотиды могут мешать [[Рибосома|рибосоме]] в комплексе с {{нп5|Эукариотические факторы инициации трансляции|эукариотическими факторами инициации трансляции|en|Eukaryotic initiation factor}} двигаться от [[кэп]]а к [[Старт-кодон|старт-кодону]]. Это предотвращает [[Трансляция (биология)|трансляцию]] [[Кодирующая область|кодирующей области]] транскрипта-мишени (нокдаун гена). Такой приём очень удобен, когда исследователь хочет определить функцию конкретного белка; по эффектам, оказываемым нокдауном гена на клетку или организм, судят о функции белка. Некоторые морфолиновые олигонуклеотиды блокируют экспрессию столь эффективно, что после деградации белка, синтезированного до введения олигонуклеотидов, этот белок становится неопределимым при помощи [[вестерн-блот]]тинга<ref>{{cite pmid|14536082}}</ref>.

=== Изменение сплайсинга пре-мРНК ===
Морфолиновые олигонуклеотиды могут вмешиваться в [[Процессинг РНК|процессинг]] пре-мРНК следующими способами:
* предотвращая связывание направляющих сплайсинг малых ядерных рибонуклеопротеинов ({{нп5|snRNP||en|snRNP}}) со своими мишенями на границах [[интрон]]ов в пре-мРНК;
* блокируя остаток [[аденин]]а, осуществляет [[нуклеофил]]ьную атаку в ходе сплайсинга и образует структуру лассо;
* мешая связыванию регуляторных белков сплайсинга, таких как сайленсеры<ref>{{cite pmid|15333583}}</ref> и {{нп5|энхансеры сплайсинга||en|Exonic splicing enhancer}}<ref>{{cite pmid|16550551}}</ref>. 

Предотвращение связывания [[Рибонуклеопротеиды|рибонуклеопротеинов]] {{нп5|Сплайсосомная РНК U1|U1|en|U1 spliceosomal RNA}} (в сайте-доноре) или {{нп5|Сплайсосомная РНК U2|U2|en|U2 spliceosomal RNA}}/{{нп5|Сплайсосомная РНК U5|U5|en|U5 spliceosomal RNA}} (в {{нп5|Полипиримидиновый тракт|полипиримидиновом тракте|en|Polypyrimidine tract}} или сайте-акцепторе) может привести к модифицированному сплайсингу, при котором из зрелой мРНК исключаются [[экзон]]ы. Воздействие на другие сайты сплайсинга приводит к включению интронов в зрелую мРНК, в то время как активация скрытых сайтов сплайсинга может приводит и к включениям, и к исключениям<ref>{{cite pmid|17493584}}</ref>. Морфолиновые олигонуклеотиды могут также блокировать мишени snRNP {{нп5|Сплайсосомная РНК U11|U11|en|U11 spliceosomal RNA}}/{{нп5|Сплайсосомная РНК U12|U12|en|U12 minor spliceosomal RNA}}<ref>{{cite pmid|18022366}}</ref>. Изменения в сплайсинге удобно отслеживать при помощи [[ПЦР с обратной транскрипцией]] (RT-PCR) и [[электрофорез]]а (при электрофорезе продуктов RT-PCR наблюдается смещение полос в геле)<ref name="Draper" />.

=== Другие применения ===
Морфолиновые олигонуклеотиды использовались для блокировки активности [[микроРНК]]<ref>{{cite pmid|15585662}}</ref><ref>{{cite pmid|17220889}}</ref>, а также их созревания<ref>{{cite pmid|17676975}}</ref>. Морфолиновые олигонуклеотиды, меченные [[флуоресцеин]]ом, в сочетании с [[антитела]]ми, специфичными к флуоресцеину, могут использоваться в качестве проб {{нп5|In situ-гибридизация|''in situ''-гибридизации|en|In situ hybridization}} с микроРНК<ref>{{cite pmid|23213449}}</ref>. Кроме того, они могут блокировать активность [[рибозим]]ов<ref>{{cite pmid|15386015}}</ref>, а также функционирование snRNP U2 и U12<ref>{{cite pmid|15731334}}</ref>. Морфолиновые олигонуклеотиды, нацеленные на «оголённые» последовательности мРНК в пределах кодирующей области, могут вызывать {{нп5|сдвиг рамки считывания||en|Translational frameshift}} при трансляции<ref>{{cite pmid|15383681}}</ref>. Они также могут блокировать [[редактирование РНК]]. Эффективность морфолиновых олигонуклеотидов по отношению ко многим мишеням делает их универсальным средством для подавления взаимодействия белков или нуклеиновых кислот с мРНК<ref>{{cite pmid|23172291}}</ref>.

== Специфичность, стабильность и не-антисмысловые эффекты ==
Морфолиновые олигонуклеотиды стали стандартным инструментом для нокдауна генов в [[эмбрион]]альных системах животных, в которых экспрессируется больше генов, чем во взрослых клетках. После инъекции морфолинового олигонуклеотида в зародыши лягушки или рыбы на стадии одной или нескольких клеток наибольший эффект проявляется к пятому дню<ref name = "BillPrimerZfish">{{cite pmid|19374550}}</ref>, когда большая часть [[органогенез]]а и [[Дифференцировка клеток|дифференцировки клеток]] и [[Ткань (биология)|тканей]] уже позади; наблюдаемые [[фенотип]]ы соответствуют нокауту определённого гена. {{нп5|Контрольный эксперимент|Контрольные|en|Scientific control}} нуклеотиды, не нацеленные на какие-либо последовательности, как правило, не вызывают изменений в фенотипе зародыша, подтверждая, что морфолиновые олигонуклеотиды действуют специфично к последовательностям и, как правило, не имеют не-антисмысловых эффектов. Дозу, необходимую для нокдауна гена, можно сократить, одновременно вводя несколько морфолиновых олигонуклеотидов, нацеленных на одну и ту же мРНК; этот приём позволяет сократить или вовсе исключить зависимые от дозы взаимодействия олигонуклеотидов с РНК, не являющимися непосредственными мишенями<ref>{{cite pmid|18196596}}</ref>. 

В экспериментах по «спасению» мРНК у зародышей часто удавалось вернуть фенотип [[Дикий тип|дикого типа]]. В ходе этих экспериментов морфолиновый олигонуклеотид вводится в клетку вместе с мРНК, кодирующей тот белок, на нокдаун которого этот олигонуклеотид и направлен. Однако вводимая мРНК имеет изменённую [[5'-нетранслируемая область|5'-нетранслируемую область]], а потому не имеет последовательности-мишени для морфолинового олигонуклеотида, но её [[кодирующая область]] сохранена и с неё синтезируется интересующий белок. Трансляция с мРНК-«спасателя» восстанавливает образование белка, остановленное морфолиновым олигонуклеотидом. Спасательная мРНК не вызывает фенотипических отклонений, так как не действует на экспрессию генов, не являющихся мишенью введенного олигонуклеотида, поэтому возврат к фенотипу дикого типа служит ещё одним доказательством специфичности морфолиновых олигонуклеотидов по отношению к последовательности<ref name = "BillPrimerZfish" />.

Из-за совершенно неестественного химического строения морфолиновые олигонуклеотиды не распознаются клеточными белками. [[Нуклеаза|Нуклеазы]] их не разрушают<ref>{{cite pmid|9012862}}</ref>, поэтому они не разрушаются ни в клетках, ни в [[Плазма крови|плазме крови]]<ref>{{cite pmid|17226957}}</ref>. Морфолиновые олигонуклеотиды не активируют [[Толл-подобные рецепторы|Toll-подобные рецепторы]], а потому не запускают [[Врождённый иммунитет|врождённый]] [[иммунный ответ]], выражающийся, в частности, в образовании [[интерферон]]а или в [[NF-κB]]-опосредованном [[Воспаление|воспалении]]<ref>{{статья |url=https://www.gene-tools.com/sites/default/files/Brief%20Introduction-3.pdf |заглавие=A Brief Introduction to Morpholino Antisense |автор=Jon D. Moulton |год=2011}}</ref>.

До 18 % морфолиновых олигонуклеотидов вызывают не связанные с исходными мишенями фенотипы, в частности, смерть клеток [[Центральная нервная система|центральной нервной системы]] и [[сомит]]ов у зародышей данио-рерио<ref>{{cite pmid|11477681}}</ref>. Было показано, что большая часть этих эффектов связана с активацией [[p53]]-опосредованного [[апоптоз]]а; их можно подавить, одновременно вводя экспериментальный морфолиновый олигонуклеотид и его анти-p53-аналог. Более того, вызванную морфолиновым олигонуклеотидом активацию p53-опосредованного апоптоза удалось повторить с использованием других антисмысловых структур, что говорит в пользу того, что p53-опосредованный апоптоз может быть вызван утратой белка-мишени и не зависит от типа олигонуклеотида, используемого для нокдауна<ref>{{cite pmid|17530925}}</ref>.

Морфолиновые олигонуклеотиды следует использовать с осторожностью из-за их потенциальных эффектов вне белка-мишени. Для проверки того, является ли наблюдаемый фенотип морфанта результатом нокдауна задуманного гена или же он вызван взаимодействием с РНК, не являющейся непосредственной мишенью введенного олигонуклеотида, можно провести второй эксперимент. Этот эксперимент заключается в повторении фенотипа ([[Фенокопия|фенокопировании]]) морфанта с использованием другого морфолинового олигонуклеотида, нацеленного на ту же мишень, но не перекрывающегося с первым олигонуклеотидом<ref name = "BillPrimerZfish" />.

== Доставка ==
Для того, чтобы морфолиновый олигонуклеотид мог подействовать, он должен попасть в цитозоль клетки и преодолеть [[Плазматическая мембрана|клеточную мембрану]]. После попадания в цитозоль он начинает свободно [[Диффузия|диффундировать]] между цитозолем и [[Ядро клетки|ядром]], как было показано в экспериментах, при которых введение морфолинового нуклеотида в цитозоль клетки изменяло сплайсинг в ядре<ref name="Draper" />. Для доставки морфолинового олигонуклеотида в зародыши, клетки культуры или клетки взрослых животных используются различные методы. 

Для доставки в зародыши, как правило, используют {{нп5|микроинъекции||en|Microinjection}}, причём введение олигонуклеотидов обычно осуществляют на стадии одной или нескольких клеток<ref>{{cite pmid|19274045}}</ref>. Альтернативный метод для доставки морфолиновых олигонуклеотидов в эмбрионы — электропорация, которая позволяет доставить их в ткани на более поздних стадиях развития зародыша<ref>{{cite pmid|16837210}}</ref>. 

Наиболее распространённые методы для доставки морфолиновых олигонуклеотидов в клетки культуры — использование эндопортерного пептида ({{lang-en|Endo-Porter peptide}}), который вызывает высвобождение морфолиновых олигонуклеотидов из эндосом<ref name="Summerton" />; система специальной доставки ({{lang-en|Special Delivery system}}), использующая [[гетеродуплекс]] ДНК с морфолиновым олигонуклеотидом и {{нп5|Этоксилирование|этоксилированный|en|Ethoxylation}} {{нп5|полиэтиленимин||en|Polyethylenimine}} в качестве реагента доставки (больше коммерчески недоступна)<ref name="Morcos" />; электропорация<ref>{{cite pmid|15375324}}</ref>; метод соскоба-загрузки ({{lang-en|scrape loading}})<ref>{{cite pmid|8915501}}</ref>. В 2015 году была описана транс-активирующая амфипатическая система доставки, основанная на ДНК, которая предназначена для удобной доставки незаряженных нуклеиновых кислот, имеющих поли(А)-хвост, таких как [[пептидо-нуклеиновые кислоты]] и морфолиновые олигонуклеотиды<ref>{{статья |заглавие=Amphipathic trans-acting phosphorothioate DNA elements mediate the delivery of uncharged nucleic acid sequences in mammalian cells |автор=H. V. Jain, D. Verthelyi and S. L. Beaucage |издание=RSC Adv. |год=2015| doi=10.1039/C5RA12038A |volume=5 |pages= 65245—65254 |url=http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2015/RA/c5ra12038a#!divAbstract}}</ref>.

Доставка морфолиновых олигонуклеотидов в ткани взрослых животных затруднительна, хотя разработано несколько систем, позволяющих доставить в ткани немодифицированные морфолиновые олигонуклеотиды (в частности, в от природы слабые мышечные клетки при мышечной дистрофии Дюшена<ref>{{cite pmid|16285002}}</ref> или в клетки сосудистого [[Эндотелий|эндотелия]], подвергающиеся стрессу при {{нп5|Ангиопластия|ангиопластии|en|Angioplasty}}<ref>{{cite pmid|12020498}}</ref>). Хотя морфолиновые олигонуклеотиды эффективно проходят через межклеточные промежутки в тканях, доставка их в клетки сложна. Системная доставка в клетки многих типов может быть осуществлена при помощи морфолиновых олигонуклеотидов, ковалентно связанных с {{нп5|Проникающие в клетки пептиды|проникающими в клетки пептидами|en|Cell-penetrating peptide}} ({{lang-en|Cell-penetrating peptide}}), и, в то время как [[Токсин|токсичный]] эффект оказывают средние дозы связанных [[пептид]]ов<ref>{{cite pmid|17097177}}</ref><ref>{{cite pmid|17344287}}</ref>, в условиях ''[[in vivo]]'' удалось добиться эффективной доставки морфолиновых олигонуклеотидов при дозах пептидов ниже токсичных<ref name="Deas" /><ref>{{cite pmid|17583927}}</ref>. Октагуанидиновый [[дендример]], прикреплённый к концу морфолинового олигонуклеотида (т. н. Vivo-Morpholino), обеспечивает его доставку из [[Кровь|крови]] в цитозоль при систематическом введении во взрослого [[Животные|животного]]<ref>{{cite pmid|18564870}}</ref><ref name="FirstVivo">{{cite pmid|19238792}}</ref>. 

== Медицинское значение ==
Морфолиновые олигонуклеотиды, способные к эффективной доставке (такие как связанные с пептидами морфолиновые олигонуклеотиды и Vivo-Morpholino), могут быть перспективными средствами для лечения [[Вирусные заболевания|вирусных]] и генетических заболеваний<ref>{{cite pmid|19325525}}</ref>.
Например, {{нп5|Sarepta Therapeutics||en|Sarepta Therapeutics}} Inc. уже разрабатывает морфолиновые олигонуклеотиды — потенциальные лекарства под названием NeuGene. В настоящее время проходят [[клинические испытания]] морфолиновые олигонуклеотиды, которые могут использоваться для лечении [[Миодистрофия Дюшенна|миодистрофии Дюшенна]] у [[человек]]а<ref>{{cite web |url=http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01396239 |title=Efficacy Study of AVI-4658 to Induce Dystrophin Expression in Selected Duchenne Muscular Dystrophy Patients |access-date=2015-10-25 |archive-date=2015-12-08 |archive-url=https://web.archive.org/web/20151208145628/https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01396239 |deadlink=no }}</ref>.

== Примечания ==
{{примечания|2}}

== Литература ==
* {{книга
 | автор         = Б. Аппель и др.
 | заглавие      = Нуклеиновые кислоты: от А до Я
 | ссылка        = https://archive.org/details/isbn_9785996303762
 | ответственный = под ред. С. Мюллер
 | место         = М.
 | издательство  = БИНОМ. Лаборатория знаний
 | год           = 2013
 | том           = 
 | страниц       = 413
 | страницы      = [https://archive.org/details/isbn_9785996303762/page/n206 206]
 | isbn          = 978-5-9963-0376-2
 | doi           = 
 | ref           = Аппель и др.
}}
* {{cite pmid|26474085}}
* {{cite pmid|26380905}}
* {{cite pmid|23140456}}

== Ссылки ==
* {{cite web |url=http://www.gene-tools.com/ |title=Gene Tools: Morpholino antisense oligos}}

{{Нуклеиновые кислоты}}
{{Хорошая статья|Биология}}

[[Категория:Нуклеиновые кислоты]]
[[Категория:Диамидофосфаты]]
[[Категория:Методы биологических исследований]]