Просмотр кода страницы Негомологичное соединение концов

[[Файл:1756-8935-5-4-3-l.jpg|мини|496x496пкс|Негомологичное соединение концов (слева) и гомологичная рекомбинация (справа) в клетках млекопитающих]]
'''Негомологи́чное соедине́ние концо́в'''{{sfn|Кребс, Голдштейн, Килпатрик|2017|с=406}}, или '''негомологи́чное воссоедине́ние концо́в'''{{sfn|Прошкина, Юранева, Москалев|2018|с=22}} ({{lang-en|non-homologous end joining, NHEJ}}) — один из путей [[Репарация ДНК|репарации]] двунитевых разрывов в [[ДНК]]. Негомологичным этот процесс называется потому, что повреждённые концы цепи соединяются [[Лигаза|лигазой]] напрямую, не нуждаясь в [[Гомология (биология)|гомологичном]] шаблоне, в отличие от процесса [[Гомологичная рекомбинация|гомологичной рекомбинации]]<ref name="Moore and Haber"/><ref>{{cite pmid|8890183}}</ref><ref name="Wilson and Lieber">{{cite pmid|10438542 }}</ref><ref>{{cite pmid|15692565}}</ref>. NHEJ существенно менее точен, чем гомологичная рекомбинация, и часто он приводит к потере [[нуклеотид]]ов, [[транслокация]]м или слиянию [[Теломеры|теломер]], при этом последние два могут являться признаками [[Опухоль|опухолевой]] клетки<ref>{{Cite pmid|11980718}}</ref>. NHEJ обнаружен у представителей всех [[Царство (биология)|царств]] живой природы, кроме того, в [[Клетка (биология)|клетках]] [[Млекопитающие|млекопитающих]] он служит основным путём репарации двуцепочечных разрывов<ref name="pmid15175156">{{Cite pmid|15175156}}</ref>.

== У прокариот ==
Многие [[Вид (биология)|виды]] [[Бактерии|бактерий]], включая ''[[Escherichia coli]]'', не имеют NHEJ, а потому вынуждены полагаться только на гомологичную рекомбинацию в случае повреждения ДНК бактерии. Однако [[Белок|белки]], участвующие в NHEJ, были обнаружены у некоторых бактерий, например, у ''[[Bacillus subtilis]]'', ''[[Mycobacterium tuberculosis]]'' и ''[[Mycobacterium smegmatis]]''<ref name="pmid12215643">{{Cite pmid|12215643}}</ref><ref name="pmid15778718">{{Cite pmid|15778718}}</ref>. Бактерии используют исключительно компактную версию NHEJ, где все необходимые действия выполняются всего двумя белками: [[Белковый димер|гетеродимером]] белка [[Ku]] и многофункциональной [[Лигаза|лигазой]]/[[Полимераза|полимеразой]]/[[Нуклеаза|нуклеазой]] [[LigD]]<ref name="pmid15499016">{{Cite pmid|15499016}}</ref>. У микобактерий NHEJ гораздо больше подвержен ошибкам, чем у [[Дрожжи|дрожжей]]<ref name="pmid15778718" />. Многие бактерии, обладающие белками NHEJ, проводят значительную часть своего жизненного цикла в [[Рост бактерий|стационарном]] [[гаплоид]]ном состоянии, когда шаблон для рекомбинации недоступен и гомологичная рекомбинация невозможна<ref name="pmid12215643" />. Возможно, у этих бактерий NHEJ помогает восстанавливать двуцепочечные разрывы, возникающие при высыхании<ref name="pmid17360246">{{Cite pmid|17360246}}</ref>. Corndog и Omega, два родственных [[Бактериофаги|бактериофага]] из ''Mycobacterium smegmatis'', также используют NHEJ, чтобы разомкнуть свой [[геном]] во время инфекции<ref name="pmid16949369">{{Cite pmid|16949369}}</ref>.

NHEJ является одним из путей восстановления двуцепочечных разрывов и у [[Археи|архей]]. У архей NHEJ также включает связывание и удержание концов разрыва белками Ku с последующим застраиванием бреши. У архей Ku связывают концы, которые были «подрезаны» [[Экзонуклеазы|экзонуклеазой]] так, что образуется выступающий 3'-конец, который может быть продлен за счёт синтеза цепи ДНК с вытеснением старой цепи [[ДНК-полимераза|ДНК-полимеразой]]<ref>{{cite doi|10.3390/biom10111472}}</ref>.

== У эукариот ==
В отличие от бактерий, [[Эукариоты|эукариотический]] NHEJ использует обширный ряд белков, участвующих в осуществлении следующих шагов<ref>{{cite doi|10.1016/j.dnarep.2014.02.020}}</ref>:
* Распознавание двунитевого разрыва ДНК гетеродимерным белком [[Ku70]]/[[Ku80]];
* Сборка и стабилизация комплекса NHEJ-белков на месте повреждения ДНК;
* Смыкание концов разрыва и их стабилизация;
* Активация киназной активности ДНК-зависимой протеинкиназы ({{нп5|ДНК-зависимые протеинкиназы||en|DNA-PKcs}});
* Процессинг концов разрыва, если требуется;
* Лигирование концов разрыва;
* Распад комплекса NHEJ-белков на месте отрепарированного разрыва.

Когда механизм NHEJ неактивен, двунитевые разрывы могут быть устранены альтернативным путём, более подверженным ошибкам, — путём [[Микрогомологичное соединение концов|микрогомологичного соединения концов]] ({{lang-en|microhomology-mediated end joining (MMEJ)}}). При этом пути по обе стороны от разрыва сначала образуются короткие гомологичные последовательности (микрогомологи), которые затем подравниваются в ходе репарации<ref name="pmid18809224">{{Cite pmid|18809224}}</ref>.

=== Связывание и фиксирование концов ===
У дрожжей [[Белковый комплекс|комплекс]] {{нп5|Комплекс MRX|MRX|en|MRX complex}}, состоящий из белков Mre11, Rad50 и Xrs2, привлекается в процесс репарации рано и, как предполагается, помогает сцеплять ДНК-концы<ref>{{cite pmid|11741545}}</ref>. Соответствующий комплекс у млекопитающих, известный как комплекс ([[Комплекс MRN|MRN]]), состоит из белков Mre11, Rad50 и [[Нибрин|Nbs1]] и также вовлекается в NHEJ, но он может действовать и
на других этапах процесса, помимо удержания концов разрыва в непосредственной близости друг от друга<ref name="pmid19654615">{{Cite pmid|19654615}}</ref>.

Эукариотический белок Ku представляет собой гетеродимер, состоящий из [[Ku70]] и [[Ku80]], формирующий комплекс с ДНК-зависимой протеинкиназой, которая есть у млекопитающих, но отсутствует у дрожжей. Белок Ku имеет форму корзинки и «скользит» вдоль ДНК-цепи. По сути, он выступает сенсором, обнаруживающим повреждения ДНК{{sfn|Кребс, Голдштейн, Килпатрик|2017|с=406}}. Он может функционировать и в качестве сайта докинга для других [[Молекула|молекул]], вовлеченных в NHEJ, а также взаимодействует с комплексом [[ДНК-лигаза|ДНК-лигазы]] IV и белком {{нп5|XLF||en|
Non-homologous end-joining factor 1}}<ref name="pmid18832348">{{Cite pmid|18832348}}</ref><ref name="pmid18064046">{{Cite pmid|18064046}}</ref>.

=== ДНК-зависимая протеинкиназа DNA-PK ===
У эукариот центральную роль в NHEJ-репарации и ответе на повреждение ДНК играет ДНК-зависимая протеинкиназа DNA-PK, состоящая из каталитической субъединицы DNA-PKcs, соединённой с С-концом белка [[Ku80]]. DNA-PKcs рекрутируется к С-концу белка Ku80 после образования комплекса Ku70/Ku80 на концах двунитевого разрыва ДНК. После этого DNA-PKcs аутофосфорилируется и фосфорилирует ряд белков, участвующих в ответе на повреждение ДНК, включая белок {{нп5|Artemis (белок)|Artemis|en|Artemis (protein)}}<ref>{{статья |автор=Chirgadze D. Y. et al. |заглавие=DNA-PKcs, allostery, and DNA double-strand break repair: defining the structure and setting the stage  |ссылка=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5495172/ |язык=en |издание=Methods in enzymology |тип= |год=2017 |месяц= |число= |том=592 |номер= |страницы=145—157 |doi=10.1016/bs.mie.2017.04.001 |issn=}}</ref>. Предполагается, что {{нп5|ДНК-зависимые протеинкиназы||en|DNA-PKcs}} тоже участвуют в соединении концов во время NHEJ<ref>{{Cite pmid|12065431}}</ref>.

=== Обработка концов разрыва ===
Обработка концов включает в себя удаление нескольких нуклеотидов из выступающих концов с помощью нуклеазы и восстановления двуцепочечной структуры посредством [[ДНК-полимераза|ДНК-полимеразы]]. Этот шаг не является необходимым, если концы уже совместимы, то есть имеют свободные 3'-[[Гидроксильная группа|гидроксильную]] и 5'-[[Фосфаты|фосфатную]] группу. Например, белок {{нп5|Artemis (белок)|Artemis|en|Artemis (protein)}}, активируемый ДНК-зависимой [[Протеинкиназы|протеинкиназой]], может функционировать и как [[Эндонуклеазы|эндонуклеаза]], и как [[Экзонуклеазы|экзонуклеаза]] в ходе [[V(D)J-рекомбинация|V(D)J-рекомбинации]]. Mre11 обладает активностью нуклеазы, но, по-видимому, вовлечён в процесс гомологичной рекомбинации, а не NHEJ. Далее ДНК-полимеразы {{нп5|ДНК-полимераза лямбда|λ|en|DNA polymerase lambda}} и {{нп5|ДНК-полимераза мю|μ|en|DNA polymerase mu}} (Pol4 у дрожжей) восстанавливают двуцепочечную структуру ДНК на месте выступающих одноцепочечных концов. Таким образом, концы разрыва делаются {{нп5|Липкие и тупые концы|тупыми|en|Sticky and blunt ends}}<ref name="Wilson and Lieber" /><ref>{{Cite pmid|15242403}}</ref><ref name="ReferenceA">{{Cite pmid|15964833}}</ref>{{sfn|Кребс, Голдштейн, Килпатрик|2017|с=406}}.

=== Лигирование ===
Комплекс ДНК-лигазы IV, состоящий из [[Катализ|каталитической]] [[Белковая субъединица|субъединицы]] {{нп5|LIG4|ДНК-лигазы IV|en|LIG4}} и [[кофактор]]а {{нп5|XRCC4||en|DNA repair protein XRCC4}} (Dnl4 и Lif1 у дрожей), осуществляет лигирование на завершающем этапе NHEJ<ref>{{Cite pmid|9242411}}</ref>. В нём также принимает участие белок {{нп5|XLF||en|Non-homologous end-joining factor 1}} (у дрожжей Nej1)<ref>{{Cite pmid|16439205}}</ref><ref>{{Cite pmid|16439204}}</ref>. Точная роль XLF неизвестна, однако известно, что он взаимодействует с комплексом XRCC4/ДНК-лигазы IV и, вероятно, участвует в процессе лигирования<ref>{{cite pmid|16571728}}</ref>. Последние данные свидетельствуют о том, что XLF способствует реаденилированию ДНК-лигазы IV после лигирования, «перезаряжая» её, благодаря чему она может катализировать второе лигирование<ref name="pmid19056826">{{Cite pmid|19056826}}</ref>.

== Регуляция ==
Выбор между гомологичной и негомологичной репарациями повреждений ДНК регулируется на начальном этапе рекомбинации — подравнивании одноцепочечных выступающих участков. Концы, которые не подвергавшиеся подравниванию, могут быть соединены посредством NHEJ, а удаление на этапе подравнивания даже нескольких нуклеотидов подавляет NHEJ, и репарация производится посредством гомологичной рекомбинации<ref name="ReferenceA" />. NHEJ может происходить на протяжении всего [[Клеточный цикл|клеточного цикла]], но он наиболее активен в [[G1-фаза|G1]]-фазе, когда нет доступных шаблонов для гомологичной рекомбинации. Важную роль в регуляции NHEJ играет {{нп5|циклинзависимая киназа 1||en|Cyclin-dependent kinase 1}} (Cdk1; cdc28 у дрожжей), которая отключается в G1-фазе и [[Экспрессия генов|экспрессируется]] в [[S-фаза|S]] и [[G2-фаза|G2]] фазах. Cdk1 [[Фосфорилирование|фосфорилирует]] нуклеазу Sae2, что запускает подравнивание концов<ref name="pmid19473888">{{Cite pmid|19473888}}</ref>.

Запуск пути NHEJ начинается с привлечения к области повреждения белка {{нп5|53BP1||en|TP53BP1}}, который способствует дальнейшей репарации двуцепочечного разрыва по пути NHEJ. До момента подрезания концов возможно переключение на гомологичную рекомбинацию, которое достигается путём привлечения к поврежденной области белка-антагониста 53BP1 — [[BRCA1]]. Если BRCA1 вытесняет 53BP1, то двуцепочечный разрыв будет восстановлен по пути гомологичной рекомбинации<ref>{{cite doi|10.1016/B978-0-323-85679-9.00020-9}}</ref>. Помимо 53BP1 и BRCA1, в выборе пути для устранения двуцепочечного разрыва задействованы белки {{нп5|RIF1||en|Telomere-associated protein RIF1}} и CtIP — [[нуклеаза]], задействованная в подрезании концов на первых этапах гомологичной рекомбинации. Таким образом, 53BP1 и RIF1 направляют восстановление по пути негомологичного соединения концов, а BRCA1 и CtIP — по пути гомологичной рекомбинации<ref name="history">{{cite pmid|23565119}}</ref>.

Гомологичная рекомбинация для восстановления двуцепочечных разрывов может быть использована только в [[S-фаза|S]]- и [[G2-фаза]]х, когда в результате удвоения ДНК появляется матрица для репарации (поэтому NHEJ, активный во время всего клеточного цикла, является основным механизмом восстановления двуцепочечных разрывов в клетках млекопитающих). Исключение составляют области генома, содержащие повторы, например, повторы [[ген]]ов, кодирующих [[рРНК]] (рДНК). В рДНК матрица для восстановления двуцепочечного разрыва в повторе имеется в течение всего [[Клеточный цикл|клеточного цикла]], ей может выступать любой другой повтор. В случае рДНК мелкие повреждения быстро устраняются NHEJ внутри [[Ядрышко|ядрышка]] (время протекания NHEJ составляет около 30 минут, а гомологичной рекомбинации — примерно 7 часов), а крупные и сложные повреждения перемещаются вместе с белками фибриллярных центров и плотного фибриллярного компонента на периферию, образуя так называемый ядрышковый кэп. В ядрышковом кэпе происходят все, кроме самых первых, этапы гомологичной рекомбинации, при этом повторы рДНК сближаются, что способствует рекомбинации. В ядрышковых кэпах NHEJ не происходит<ref name="blokhina">{{cite doi|10.1016/j.mrfmmm.2020.111715}}</ref>. На выбор пути восстановления двуцепочечного разрыва также влияет сложность повреждения. NHEJ, как правило, используется для устранения небольших повреждений<ref>{{cite pmid|21317870}}</ref>.

== V(D)J-рекомбинация ==
{{main|V(D)J-рекомбинация}}
NHEJ играет важную роль в [[V(D)J-рекомбинация|V(D)J рекомбинации]] — процессе, посредством которого создаётся разнообразие [[B-клеточный рецептор|B-клеточных]] и [[Т-клеточный рецептор|T-клеточных]] [[Клеточный рецептор|рецепторов]] в [[Иммунная система|иммунной системе]] [[Позвоночные|позвоночных]]<ref>{{cite pmid|14744439}}</ref>. В начале процесса нуклеазы {{нп5|RAG|RAG1/RAG2|en|Recombination-activating gene}} создают двуцепочечные разрывы, защищённые [[Шпилька (биология)|шпильками]], в области особых сигнальных последовательностей<ref>{{Cite pmid|3349523}}</ref> Далее нуклеаза Artemis срезает шпильки, и образовавшиеся концы соединяются посредством NHEJ<ref name="Ma et al.">{{cite pmid|11955432}}</ref>. Специализированная ДНК-полимераза, называемая {{нп5|трансфераза концевых дезоксинуклеотидов|трансферазой концевых дезоксинуклеотидов|en|terminal deoxynucleotidyl transferase}}, работающая только в лимфоидных тканях, добавляет нешаблонные нуклеотиды к концами цепи до того, как последние будут соединены. Этот процесс перестраивает и объединяет участки V (variable), D (diversity) и J (joining), с которых потом считывается вариабельный участок Т-клеточных и В-клеточных рецепторов. В отличие от типичного NHEJ, в котором точная репарация — это самый благоприятный исход, для V(D)J-рекомбинации выгоднее, чтобы NHEJ работал с ошибками, поскольку это повышает разнообразие кодирующих последовательностей [[ген]]ов<ref>{{Cite pmid|8356452}}</ref><ref>{{Cite pmid|8356451}}</ref>.

== В теломерах ==
[[Теломеры]] обычно защищены специальным белковым «кэпом», благодаря чему они не распознаются как двухцепочечные разрывы. Потеря кэпа вызывает укорочение теломер и их соединение посредством NHEJ, что приводит к формированию дицентрической хромосомы, разрывающейся во время [[митоз]]а. Любопытно, что некоторые белки NHEJ участвуют в формировании кэпа теломеры. Например, удаление Ku, находящегося на теломерах, приводит к их укорочению<ref>{{Cite pmid|9501103}}</ref>.

== Клиническое значение ==
Несколько человеческих болезней связаны с дисфункцией NHEJ<ref name="pmid19473885">{{Cite pmid|19473885}}</ref>. Мутации, затрагивающие LIG4 и XLF, являются причиной LIG4-синдрома и XLF-связанного [[Тяжёлый комбинированный иммунодефицит|тяжёлого комбинированного иммунодефицита]] (ТКИД), соответственно. Эти синдромы имеют много характерных черт, включая клеточную радиочувствительность, микроцефалию и ТКИД, обусловленный дефектами в V(D)J-рекомбинации. Мутации в Artemis также приводят к ТКИД, но при них не развиваются неврологические дефекты, как при мутациях в LIG4 и XLF. Разница в тяжести болезней может объясняться ролью мутировавших белков: Artemis — это нуклеаза, необходимая, вероятно, только для репарации двухцепочечных разрывов с повреждёнными концами, когда как ДНК-лигаза IV и XLF принимают участие во всех вариантах NHEJ. Мутации в белках NHEJ также могут приводить к [[Атаксия телеангиэктазия|атаксии телеангиэктазии]], [[Анемия Фанкони|анемии Фанкони]], а также наследственному [[Рак груди|раку груди]] и [[Рак яичников|яичников]]. [[Мыши]], [[Нокаут гена|нокаутные]] по XRCC4 или LIG4, умирали на стадии [[Эмбриональное развитие|эмбрионального развития]], поэтому NHEJ является жизненно необходимым процессом для млекопитающих. Напротив, мыши, лишённые Ku или ДНК-зависимой протеинкиназы, оказались жизнеспособны, вероятно, потому, что NHEJ всё-таки может происходить без этих белков, хотя и на низком уровне<ref name="pmid17875923">{{Cite pmid|7875923}}</ref>.

== Влияние на старение ==
Была разработана система для измерения эффективности NHEJ в [[Клетка (биология)|клетках]] мышей<ref name="pmid25033455">{{Cite pmid|25033455}}</ref>.
С её помощью можно сравнить эффективность NHEJ в разных [[Ткань (биология)|тканях]] и у мышей разных возрастов. Наиболее активно NHEJ идёт в клетках [[Кожа|кожи]], [[Лёгкое|лёгких]] и [[Почка (анатомия)|почечных]] [[фибробласт]]ах, а в фибробластах [[Сердце|сердца]] и [[астроцит]]ах [[мозг]]а существенно ниже. Кроме того, эффективность NHEJ снижается с возрастом в 1,8—3,8 раз в зависимости от ткани. Снижение эффективности работы NHEJ ведёт к увеличению нерепарированных или плохо репарированных участков ДНК, что существенно способствует [[Старение (биология)|старению]]. Показано, что Ku80 у человека, [[Корова|коровы]] и мыши экспрессируется на значительно различающихся уровнях, причём этот уровень связан с продолжительностью жизни<ref>{{cite doi|10.1093/nar/gkm756}}</ref><ref name="pmid19896964">{{Cite pmid|19896964}}</ref>.

== История изучения ==
Первые свидетельства того, что белки Ku взаимодействуют с линейными и кольцевыми фрагментами ДНК, содержащими разрыв, были получены в 1980-х—1990-х годах. В 1986 году было показано, что Ku связывают разрывы очень эффективно: 40 [[фемто]]моль Ku связывают 90 % концов ДНК в пробе с концентрацией ДНК 25 фемтомоль. В то же время было продемонстрировано, что кольцевые [[плазмиды]], не содержащие разрывы, с белками Ku не взаимодействуют, однако начинают связывать Ku после обработки [[Эндонуклеазы рестрикции|эндонуклеазами рестрикции]]. Впоследствии было показано, что белки Ku быстро связывают концы двуцепочечного разрыва и удерживают их рядом друг с другом, позволяя им далее воссоединиться, то есть восстановить разрыв<ref>{{cite doi|10.1093/abbs/gmw046}}</ref>. В 1996 году для обозначения нового пути репарации двуцепочечных разрывов Дж. К. Мур и Дж. Э. Хабер предложили термин «негомологичное соединение концов»<ref name="Moore and Haber">{{Cite pmid|8628283}}</ref>.

== Примечания ==
{{примечания|2}}

== Литература ==
* {{книга
 | автор         = Кребс Дж., Голдштейн Э., Килпатрик С.
 | заглавие      = Гены по Льюину
 | ссылка        = 
 | ответственный = 
 | место         = М.
 | издательство  = Лаборатория знаний
 | год           = 2017
 | том           = 
 | страниц       = 919
 | страницы      = 
 | isbn          = 978-5-906828-24-8
 | doi           = 
 | ref           = Кребс, Голдштейн, Килпатрик
}}
* {{книга
 | автор         = Прошкина Е. Н., Юранева И. Н., Москалев А. А.
 | заглавие      = Молекулярная биология: стресс-реакции клетки
 | ссылка        = 
 | ответственный = 
 | место         = М.
 | издательство  = Юрайт
 | год           = 2018
 | том           = 
 | страниц       = 101
 | страницы      = 
 | isbn          = 978-5-534-06471-1
 | doi           = 
 | ref           = Прошкина, Юранева, Москалев
}}

{{Репарация ДНК}}

[[Категория:Репарация ДНК]]

{{Хорошая статья|Биология}}