Просмотр кода страницы Позиционирование нуклеосом

'''Позициони́рование нуклеосо́м''' — определение положения [[Нуклеосома|нуклеосом]] на последовательности [[ДНК]] эукариот.
Участки ДНК могут либо входить в нуклеосомные комплексы, либо быть в составе линкерной, межнуклеосомной ДНК. Эта характеристика ДНК определяет её доступность для {{нп5|Взаимодействия ДНК и белков|взаимодействия|en|Protein–DNA interaction}} с [[Белок|белками]].

== Начало развития метода ==
Разработка методов по позиционированию нуклеосом берет своё начало в 1973 году, тогда было показано свойство [[Ядро клетки|ядерного]] [[хроматин]]а под действием эндогенных [[Нуклеаза|нуклеаз]] расщепляться на серию отдельных фрагментов ДНК приблизительно равной длины. Первоначально в экспериментах в качестве нуклеазы использовалась [[дезоксирибонуклеаза I]], впоследствии широкое распространение получила [[микрококковая нуклеаза]]<ref>{{cite pmid|4711166}}</ref>.

== Позиционирование нуклеосом при использовании микрококковой нуклеазы ==

=== Классический подход ===
Экспериментальный метод определения участков ДНК, входящих в состав нуклеосом, основан на применении [[Микрококковая нуклеаза |микрококковой нуклеазы]] (метод MNase-seq). [[Клетка (биология)|Клетки]] замораживают и измельчают, дают оттаять. После оттаивания содержащий хроматин гомогенат обрабатывают микроккоковой нуклеазой. Нуклеаза расщепляет линкерные, не защищённые нуклеосомами участки ДНК. При помощи [[протеаза|протеаз]] и [[Рибонуклеазы|РНКаз]] раствор очищают от белков и [[РНК]]. ДНК экстрагируется из раствора. Применяется как [[Хроматографическая колонка|колоночная хроматография]], так варианты жидкостной экстракции — {{нп5|фенол-хлороформная экстракция||en|Phenol–chloroform extraction}}<ref>{{cite pmid|24676786}}</ref>.

ДНК осаждается [[этанол]]ом. Не все линкерные участки могли расщепиться нуклеазой. На этой стадии ДНК-продукт состоит из смеси ДНК фрагментов, соответствующих участкам, с различным покрытием нуклеосомами. Фрагменты ДНК разделяются по размеру [[электрофорез]]ом на [[Агароза|агарозном]] геле. ДНК экстрагируется из полоски геля, содержащей мононуклеосомный продукт. Полученные фрагменты ДНК приготавливают к [[Секвенирование|секвенированию]]. Распространено применение высокоэффективной технологии [[SOLiD]]. В результате секвенирования получают {{нп5|Библиотека (биология)|библиотеку|en|Library (biology)}} ДНК-фрагментов. Фрагменты картируются на [[геном]]. По величине покрытия различных участков генома судят о расположении нуклеосом по последовательности ДНК<ref name="Valouev">{{cite pmid|21602827}}</ref><ref>{{cite pmid|18477713}}</ref>.

Использование именно микроккоковой нуклеазы обусловлено тем, что она обладает как [[эндонуклеаза|эндонуклеазной]], так и [[Экзонуклеазы|экзонуклеазной]] активностями. Нуклеаза разрезает ДНК и последовательно отщепляет [[нуклеотид]]ы со свободных концов. Недостатком микроккоковой нуклеазы является предпочтение ею, как эндонуклеазы, сайтов, составленных из чередующихся нуклеотидов [[Аденин|dA]] и [[Тимин|dT]], следующими за [[Цитозин|dC]] или [[Гуанин|dG]]. В то же время она плохо распознаёт сайты из только повторяющихся dA или dT (4—6). Как экзонуклеаза микрококковая нуклеаза медленнее отщепляет нуклеотиды dC и dG. Работа фермента сильно тормозится на участках ДНК, взаимодействующих с белками. При большом времени выдержки нуклеаза начинает щепить и нуклеосомную ДНК, преимущественно в местах близости к поверхности нуклеосомы. Работа [[фермент]]а в эксперименте останавливается добавлением раствора [[ЭДТА]]<ref>{{cite pmid|20232933}}</ref>.

Метод MNase-seq может дополняться ультразвуковым разрушением и/или иммунопреципитацией гистона H3 (ChIP-seq), а также использованием таких ферментов, как ДНКаза (DNase-seq), [[транспозаза]] (ATAC-seq) и {{нп5|CpG||en|CpG site}}-{{нп5|метилтрансфераза||en|Methyltransferase}} (NOME-seq). Может использоваться непосредственное химическое разрушение ДНК между нуклеосомами, например, при помощи [[Гидроксильная группа|гидроксильного радикала]] или малых [[Ароматические соединения|ароматических]] молекул вроде метидиумпропил-ЭДТА, который внедряется в [[Двойная спираль нуклеиновых кислот|двойную спираль ДНК]] преимущественно в участках между нуклеосомами и разрушает её в присутствии [[катион]]ов [[Железо|Fe<sup>2+</sup>]] (метод MRE-seq)<ref name="r2015">{{cite pmid|26411474}}</ref>.

=== Позиционирование нуклеосом ''in vitro'' ===
При изучении различных факторов, влияющих на распределение нуклеосом по ДНК, обычно стараются выделить компоненту влияния собственно последовательности нуклеотидов. Для этого комплекс ДНК с белками гистонами собирается ''[[in vitro]]'' из предварительно очищенной от белков ДНК и [[гистон]]овых [[Олигомер|октамеров]]. Количества ДНК и гистонов берутся в определённом соотношении, приблизительно один гистоновый октамер на 850 [[Спаренные основания|пар оснований]]. Далее производятся те же манипуляции, что и в обычном методе с использованием микроккоковой нуклеазы<ref name="Valouev"/>.

== Предсказание сайтов связывания нуклеосом ==
В настоящее время развиваются методы позиционирования нуклеосом методами [[Биоинформатика|биоинформатики]]. Основа методов — экспериментально выявленные закономерности распределения нуклеосом в различных областях генома, и зависимости этих распределений от последовательности нуклеотидов ДНК<ref>{{cite pmid|20576140}}</ref>. Данные по результатам экспериментального картирования нуклеосом собраны в базе данных {{нп5|NPRD||en|Nucleosome positioning region database}} ({{lang-en|Nucleosome Positioning Region Database}})<ref>{{cite pmid|15608285}}</ref>.

== Примечания ==
{{примечания|2}}

== Ссылки ==
* {{cite web |url=http://srs6.bionet.nsc.ru/srs6bin/cgi-bin/wgetz?-page+LibInfo+-id+ZGe1iUfDo+-lib+NUCLEOSOME |title=База данных NPRD (Nucleosome Positioning Region Database)}}

[[Категория:Методы биологических исследований]]
[[Категория:Молекулярная биология]]
[[Категория:Биоинформатика]]
{{Добротная статья|Молекулярная биология}}