Просмотр кода страницы Пространственная транскриптомика

'''Простра́нственная транскрипто́мика''' — это [[Транскриптомные технологии|транскриптомная технология]], позволяющая визуализировать данные [[Секвенирование РНК|РНК-секвенирования]] в пространстве.

Организм млекопитающих состоит из различных [[Ткань (биология)|тканей]], которые, в свою очередь, состоят из различных типов и субпопуляций [[Клетка (биология)|клеток]]. Каждый из [[Список клеток тела человека|типов клеток]] обладает собственным характерным набором [[РНК]] ([[транскриптом]]ом) и [[Белки|белков]].
При стандартном [[Секвенирование|секвенировании]] тотальной [[мРНК]] в пробе исследователь получает информацию о [[транскриптом]]е всей группы клеток, поэтому молекулярные характеристики отдельных клеток теряются. Модификация такого метода — [[Транскриптомика одиночных клеток|секвенирование РНК одиночных клеток]] ({{lang-en|Single-cell RNA-seq}}) — открыла возможность получать [[Молекула|молекулярные]] идентификаторы отдельно взятых клеток, однако пробоподготовка неизбежно включает нарушение целостности ткани, поэтому тканевые координаты снова оказываются утрачены.

Пространственная транскриптомика позволяет визуализировать и количественно анализировать транскриптом в отдельных срезах тканей с пространственным разрешением.
В узком смысле пространственной транскриптомикой называют определённый метод, основанный на праймерах с уникальными молекулярными идентификаторами, в более широком смысле — все методы, решающие подобные задачи, в том числе методы гибридизации ''in situ'' и РНК-секвенирования ''in situ''.

== История ==
Методика пространственной транскриптомики была разработана в 2016 году в [[Стокгольм]]е коллективом исследователей под руководством Йонаса Фризена<ref name=":1">{{cite pmid|27365449}}</ref>. Именно этот протокол обычно подразумевается под термином «пространственная транскриптомика». С тех пор данный метод получил широкое распространение в различных областях биологических исследований<ref>{{cite doi|10.1038/s41587-019-0392-8}}</ref>.

== Методика ==
[[Файл:Spatial transcriptomics ii-ru.svg|мини|300px|Методика пространственной транскриптомики]]Методика пространственной транскриптомики может включать дополнительные шаги в зависимости от решаемой задачи и изучаемой ткани. Стандартные действия, приведенные ниже, были описаны в оригинальной статье ''Ståhl et al''<ref name=":1" />.

Стеклянная подложка условно делится на участки диаметром примерно 100 мм и расстоянием между центрами соседних участков около 200 мм. На неё наносятся олиго(дТ) [[праймер]]ы, [[Комплементарность (биология)|комплементарные]] [[Полиаденилирование|поли-А хвосту]] мРНК. Данные праймеры также содержат уникальные для каждого участка [[Баркодирование ДНК|баркоды]], уникальные молекулярные идентификаторы (UMI), сайт для [[Амплификация (молекулярная биология)|амплификации]] и сайт расщепления. Срез изучаемой ткани помещается на данную стеклянную подложку, затем [[Фиксация (гистология)|фиксируется]] и окрашивается. После пермеабилизации ткани (обработки химическими реагентами для повышения проницаемости [[Клеточная мембрана|клеточных мембран]]) проводится [[Обратная транскрипция|реакция обратной транскрипции]]. Далее ткань удаляется с подложки с помощью [[Ферменты|ферментов]]. В результате данных действий на стеклянной подложке остаётся [[Комплементарная ДНК|кДНК]], связанная с праймерами. Синтезированные молекулы кДНК срезаются с подложки по сайтам расщепления в олиго(дТ) праймерах и [[Секвенирование|секвенируются]] с использованием стандартных протоколов. Баркоды в секвенированных образцах позволяют идентифицировать исходную локализацию молекул кДНК, а также количественно охарактеризовать мРНК различных [[ген]]ов в каждом участке образца. Для дальнейшего изучения профилей экспрессии используются методы [[Снижение размерности|уменьшения размерности]], такие как [[метод главных компонент]], [[стохастическое вложение соседей с t-распределением]] и другие. Далее проводится [[иерархическая кластеризация]]. Сравнение [[Кластерный анализ|кластеров]] позволяет идентифицировать и визуализировать кластер-специфичные маркерные гены<ref name=":1" />.

== Другие методы пространственного анализа транскриптома ==
В статьях по данной тематике встречаются упоминания пространственной транскриптомики как набора всех методов пространственного анализа транскриптома. Глобально методы пространственного анализа транскриптома можно разделить на две группы<ref name=":0" />:
* Гибридизация ''[[in situ]]'';
* РНК-секвенирование ''in situ''.

=== Гибридизация ''[[in situ]]'' ===
К методам гибридизации ''in situ'' относится метод гибридизации единичной молекулы ''in situ'' (smFISH). Он основывается на синтезе библиотеки коротких олигонуклеотидных зондов, каждый из которых метится одним [[Флюорофор|флуорофором]]. Специфическое накопления этих [[Флуоресценция|флуоресцентных]] зондов на мРНК-мишени позволяет визуализировать отдельные [[Транскрипт (биология)|транскрипты]]. Ограничением smFISH является небольшое количество транскриптов, которые могут быть идентифицированы одновременно (обычно три или четыре). Это вызвано ограниченным количеством флуорофоров, которые возможно использовать параллельно<ref>{{cite doi|10.1038/nmeth.1253}}</ref>.

Существует ряд улучшений данного метода:

* мРНК метится не одним типом флуорофора, а уникальной (для данного типа мРНК) комбинацией флуорофоров. Последующее разрешение производится при помощи микроскопии сверхвысокого разрешения. Данный метод значительно увеличивает количество одновременно идентифицированных транскриптов<ref>{{cite doi|10.1038/nmeth.2069}}</ref>.
* MERFISH — мультиплексный подход, основанный на связывании одной молекулы РНК с несколькими флуоресцентно меченными зондами. Это позволяет избавиться от ошибок из-за случайной гибридизации зондов<ref>{{cite doi|10.1126/science.aaa6090}}</ref>.

Подходы smFISH тяжело применять к срезам тканей, поскольку ткани имеют свойство {{нп5|Аутофлуоресценция|аутофлуоресценции|en|Autofluorescence}}, что создает дополнительный шум. Также методы гибридизации ''in situ'' требуют предварительного отбора генов<ref name=":0">{{cite doi|10.1016/j.copbio.2017.02.004}}</ref>.

=== РНК-секвенирование ''in situ'' ===
Методы РНК-секвенирования ''in situ'' позволяют исследовать сразу весь пул мРНК, избегая предварительного отбора генов. FISSEQ (от {{lang-en|fluorescent in situ sequencing}}) основан на реакции обратной транскрипции с последующей амплификацией полученной кДНК ''in situ''. После нескольких циклов амплификации вводится четыре {{нп5|флуоресцентные метки||en|Fluorescent tag}}, соответствующие четырём типам [[Азотистые основания|оснований]]. Полученные последовательности могут быть визуализированы при помощи {{нп5|Микроскопия сверхвысокого разрешения|микроскопии сверхвысокого разрешения|en|Super-resolution microscopy}}. Анализ проводится при помощи особого метода секвенирования (partition sequencing)<ref>{{Cite web|url=https://wyss.harvard.edu/technology/fluorescent-in-situ-sequencing-fisseq/|title=Fluorescent In Situ Sequencing (FISSEQ)|date=2016-09-02|publisher=Wyss Institute|lang=en|accessdate=2020-04-22|archive-date=2020-05-03|archive-url=https://web.archive.org/web/20200503021429/https://wyss.harvard.edu/technology/fluorescent-in-situ-sequencing-fisseq/|deadlink=no}}</ref>.

Методы обеих групп ограничены разрешающей способностью [[Флуоресцентная микроскопия|флуоресцентной микроскопии]]<ref name=":0" />.

== Применение ==

=== Получение карт генной экспрессии в ткани в физиологическом состоянии ===
Карты [[Экспрессия генов|генной экспрессии]] могут быть использованы для изучения сложных взаимодействий между клетками и динамикой их совместного развития внутри ткани. С помощью пространственной транскриптомики, например, было обнаружено, что [[энтероцит]]ы в разных участках ворсинок [[кишечник]]а имеют разные профили экспресии генов и имеют ярко выраженную специализацию: клетки в основании ворсинки экспрессируют гены, кодирующие [[антимикробные пептиды]], затем следуют клетки, отвечающие за всасывание [[Пептиды|пептидов]], [[Жиры|жиров]] и [[Углеводы|углеводов]], а [[энтероцит]]ы на вершине ворсинки координируют [[NT5E|CD73]]-опосредованные пути [[Иммунный ответ|иммунного ответа]]<ref>{{cite doi|10.1016/j.cell.2018.08.063}}</ref>. В рамках другого исследования, проведённого с помощью этого метода, при сравнении профилей генной экспрессии в тканях половой системы у [[Гермафродитизм|гермафродитов]] и самцов [[Нематоды|нематод]] ''[[Caenorhabditis elegans|C. elegans]]'' был обнаружен пул пол-специфичных генов, причём среди этого пула были гены, функция которых не охарактеризована до сих пор<ref>{{cite doi|10.1016/j.devcel.2018.10.016}}</ref>. Подобные исследования планируется провести на срезах других тканей млекопитающих, и особый интерес вызывает изучение генной экспрессии в клетках [[мозг]]а<ref>{{cite doi|10.1126/science.aan6827}}</ref>. Также техника пространственной транскриптомики была адаптирована для работы с образцами тканей [[Растения|растений]]<ref>{{cite doi|10.1038/nrg.2017.41}}</ref>.

=== Патологические нарушения генной экспрессии, поиск биомаркеров ===
Аналогично картам [[Экспрессия генов|генной экспрессии]] здоровых тканей, можно анализировать карты тканей с различными [[патология]]ми. Это может продвинуть поиски [[биомаркер]]ов заболевания и других [[Диагностика (медицина)|диагностических]] признаков. К примеру, с помощью пространственной транскриптомики был составлен «атлас [[опухоли]]» — карта генной экспрессии на срезе [[Поджелудочная железа|поджелудочной железы]], поражённой [[Аденокарцинома|протоковой аденокарциномой]]<ref>{{cite doi|10.1101/254375}}</ref>.

=== Математическое моделирование метаболических процессов ===
Молекулярная разметка ткани может быть использована для более точного построения [[Метаболизм|метаболических]] моделей [[Орган (анатомия)|органов]]. Подобные модели используют как для исследования физиологии органа в целом, так и для предсказания действия потенциальных [[Фармацевтика|фармацевтических]] препаратов на рассматриваемый орган<ref>{{cite doi|10.1016/j.ymben.2009.10.004}}</ref>.

Подобная модификации актуальна, например, для модели [[Печень|печени]]. Существующие модели рассматривают весь орган как гомогенную систему, состоящую из клеток-генералистов, то есть способных выполнять широкий спектр функций<ref>{{cite doi|10.1038/msb.2010.62}}</ref>. Однако существуют данные о том, что присутствует локальная специализация [[Гепатоциты|гепатоцитов]] для выполнения конкретных функций. В таком случае, гепатоциты в разных специализированных субпопуляциях должны иметь разный набор РНК-транскриптов, что можно было бы проверить с помощью методов пространственной транскриптомики<ref>{{cite doi|10.3748/wjg.v20.i26.8491}}</ref>.

== Примечания ==
{{примечания}}

[[Категория:РНК]]

{{Добротная статья|Биоинформатика}}