Allium test

Allium test — растительная тест система для анализа мутагенных факторов химической и физической природы на основе растения Allium cepa (сорт Штутгартен).

Allium-test — в котором в качестве материала используются корешки проростков репчатого лука Allium cepa, который впервые предложен Шведской Королевской Академией Наук как стандартный тест-объект .

Биотест Allium cepa разработан А. Леваном в 1938 году, и в это же время использовался для изучения эффекта влияния колхицина, получив много внимания при этом. В настоящее время Allium-test используется наряду с постоянно увеличивающимся числом объектов (среди растений наиболее часто — горох Pisum sativum и бобы Vicia faba) продолжает оставаться одним из наилучших тест-объектов для анализа генотоксичности различных факторов.

Данный метод не требует знания кариотипа и идентификации типов повреждений хромосом, является простым, экономичным и достаточно чувствительным для определения «мутаген» или «не мутаген» фактор.

Allium test рекомендован экспертами ВОЗ как стандарт в цитогенетическом мониторинге окружающей среды, так как результаты, полученные на данном тесте, показывают корреляцию с тестами на других организмах: водорослях, растениях, насекомых, в том числе и млекопитающих .

История создания Allium test

История метода «Allium Test», преимущества перед другими методами и перспективы

Биотест Allium cepa разработан более 70 лет назад А. Леваном в 1938 и использовался для изучения эффекта влияния колхицина, получив много внимания в это время. В настоящее время термин Allium-test используется на ряду с постоянно увеличивающимся числом объектов и при этом продолжает оставаться одним из наилучших тест-объектов для анализа генотоксичности различных факторов. После А. Левана разработкой биотестирования с помощью лука обыкновенного занимался шведский ученый Dr. Geirid Fiskesjo в 80-х годах. Вот его собственная оценка данного метода:

• Растения легки для хранения и ухода, широко распространены и недорогие. Вообще, состояние хромосомы клеток растения — хорошее, поэтому обеспечивает высокое качество в контрольных условиях.
• Биотест Allium cepa является относительно быстрым, легким для выполнения испытанй, а также высокочувствительным и воспроизводимым. Это также обеспечивает сходимые результаты с целым рядом других тестовых систем.
• Как макроскопический, так и микроскопический эффекты, обладают хорошей корреляцией между собой. Макроскопический эффект (сдерживание корневого прироста) является самым чувствительным параметром. Сдерживание прироста является следствием прямых или косвенных вредных эффектов. Микроскопическое исследование позволяет оценить повреждения хромосом и нарушения деления клеток, и поэтому обеспечивает дополнительную информацию относительно остроты, механизма генотоксического эффекта или потенциальной мутагенности.
• Корневые клетки обладают определенными энзимами, выполняющими функции оксидаз, которые способствуют превращению многих не мутагенных веществ в мутагенные. Эта система активации позволяет обнаружить те химические вещества, которые усиливают свой токсический эффект в процессе метаболизма.
• Система имеет широкий ряд применений, например, для проверки химической чистоты питьевой, природной воды, а также промышленного ущерба и т. п., и полезен для оценки и классификации экологических химикатов с ссылкой на токсичность.
• Биотест может также использоваться для измерения относительной токсичности нерастворимых в воде соединений, при условии, что они могут быть растворены в подходящем растворителе, а затем разбавлены в воде таким образом, что остаточная концентрация не превысит определенных пределов. В таких случаях для контроля растворителей должен также быть организован тестовый режим. биотест действует над широким рядом pH (3.5-11.0) без каких-нибудь очевидных эффектов на приросте корневых систем. Поэтому умеренно кислые/щелочные образцы воды, химические растворы, и т. п. могут быть исследованы без необходимой корректировки pH.
• Биотест с использованием Allium cepa высокочувствителен и может дать позитивные токсические эффекты в случаях, когда исследуемые пробы проверены в других системах (особенно высшие организмы, как например рыбы) и по их результатам не токсичны. Позитивные результаты в этой тестовой системе указывают потенциальный биологический риск. Экстраполяция результатов от одной тестовой системы к другой (и в конечном счете к человеку) должна быть основанной на результатах серии испытаний и с должным рассмотрением к метаболическим превращениям тестируемого образца.
• В сравнении с другими краткосрочным альтернативным биотестами на токсичность этот тест показал хорошую сходимость с результатами других тестовых систем, использующих множество других организмов, как эукариотов, так и прокариотов. Результаты таких сравнений описаны ниже:

• В исследованиях на бензопирен китайская система с использованием клеток хомяка V79 без учёта метаболических эффектов системы активизации являются менее чувствительными, чем Allium сера. Относительная чувствительность меняется с учётом влияния функций оксидаз. Несмотря на изменения в чувствительности общие результаты между двумя системами сравнимы.
• Испытания, проведенные на человеческих лимфоцитах, которые оказались немного более чувствительными к эффектам органических ртутных соединений, чем клетки меристемы корней Allium cepa, в целом однотипны. Нужно также отметить, что изучение микроскопических параметров обоих клеток дают подобный эффект (c-митоз).
• Результаты биотеста с использованием Allium cepa также сравнивались с результатами исследований на автотрофных морских водорослях, гетеротрофных микроорганизмах и активными грязевыми отложениями. Целый ряд химических веществ быль|были проверены в биотесте Allium сера и в тестах на 16 различных морских водорослях (зеленые морские водоросли и кремневые морские водоросли), дрожжах (Saccharomyces cerevisiae), простейших (Tetrahymena pyriformis) и активных грязевых отложениях (сообщество бактерий, дрожжей и простейших). Результаты были целиком сравнимы, хотя были видимы некоторые отличия в чувствительности. Большинство морских водорослей были чувствительнее, чем Allium сера, тогда как дрожжи, простейшие и активные грязевые отложения были менее чувствительны.
• Целый ряд водных растений и животных оказался менее чувствительным к определенным классам веществ сравнению с биотестом Allium например рыбы (Gasterosteus aculeatus), водные животные (Daphnia magna, Brachydario rerio — яйца или икра бактерии Microtox) и растения (одноклеточные морские водоросли).
• Биотестирование с помощью Allium сера, в данном случае, является лучшим методом определения экологического риска за счет его высокой чувствительности. Другие животные (например. Nitocra spinipes) и растения (напр. морские водоросли и одноклеточные) представляют сопоставимые результаты рассматриваемому биотесту

Преимущества метода Allium cepa

Преимущества растительной тест-системы Allium cepa

Данный метод не требует знания кариотипа и идентификации типов повреждений хромосом, является простым, экономичным и достаточно чувствительным для определения «мутаген» или «не мутаген» фактор.

Метод позволяет регистрировать хромосомные мутации типа делеций и транслокаций, следствием которых является наличие мостов и фрагментов в ана- и телофазе. Кроме того метод позволяет выявлять изменение поведения хромосом на веретене деления.

Преимущества растительных тест систем на примере лука Allium cepa

Растительные тест-системы в настоящее время получают всё большее распространение при оценке мутагенного загрязнения окружающей среды. Это обусловлено целым рядом преимуществ растений как индикаторов генотоксичности различных факторов, так и сигнальных объектов при генетическом мониторинге за состоянием окружающей среды:

• Растения — неизменный объект для натурных исследований антропогенного влияния на окружающую среду: первыми принимают на себя удар загрязнителей, не мигрируют подобно животным, что позволяет чётко рассчитать время воздействия.
• Растения — эукариотические организмы, поэтому на них, в отличие от микроорганизмов, можно регистрировать все типы генетических повреждений:

• генные,
• хромосомные,
• геномные.

• Методы работы с растительными объектами экономичны, требуют минимального количества оборудования и реактивов, выращивание растений менее трудоёмко, чем выращивание животных.
• Можно получать материал нужных стадий.
• Эксперименты можно вести в строго контролируемых условиях — как в острых, так и в хронических опытах (от нескольких часов до нескольких лет).
• Данные по мутагенезу ряда факторов на растительных объектах показывают хорошую корреляцию с результатами тестирования на животных.
• Растения позволяют регистрировать как прямые, так и косвенные мутагены.
• Только растения позволяют выявить такой важный класс мутагенов, как химические соединения, приобретающие мутагенность в процессе метаболической активации растительными ферментами.
• Некоторые факторы, высокая токсичность которых не позволяет учесть генетические повреждения на животных, могут быть оценены как мутагены только в растительных тест-системах.
• Растения могут выращиваться непосредственно на месте оценки суммарного генетического эффекта загрязнения определяемых участков.

Характеристика лука Allium cepa L., применимость в тестах

Allium cepa L. (отдел Angiospermae, класс Liliopsida, подкласс Lilidae, порядок Liliales, семейство Alliaceae, род Allium L.) в качестве тест объекта широко применяется для оценки генетического потенциала химических соединений, природных и сточных вод. Лук имеет 16 хорошо прокрашиваемых хромосом (2n=16). Продолжительность клеточного цикла составляет примерно 17,8 часа. Митотический индекс может колебаться в разных корнях одного и того же растения, но усреднённые данные являются достаточно устойчивыми. Продолжительнсть митоза в разных тканях корня Allium cepa одинакова и не меняется по длине корня. Соотношение различных фаз митоза не зависит от времени фиксации.

Тесты с использованием меристематических тканей проростков корешков лука позволяют регистрировать токсические (прирост корешков), митозмодифицирующие (нарушение митотической активности меристемы, патология веретена деления) и мутагенные эффекты (индукции микроядер и хромосомные мутации).

Наиболее часто применяется анализ частоты хромосомных аберраций в ана-телофазе митоза (ана-телофазный тест). В этом тесте регистрируются хромосмные мутации типа делеций и транслокаций, а также нарушения веретена деления по частоте отставания хромосом, многополюсных и ассиметричных митозов. Ана-телофазный метод с использованием лука в качестве тест объекта рекомендован в качестве тест объекта природных сред. При сравнении мутагенной активности химических загрязнителей, определённых в других токсикогенетических тестах с ана-телофазным методом установлено, что чувствительность его высока и составляет 82 %.

Однако учёт только хромосмных аберраций может привести к занижению реального генотоксического эффекта, например, по следующим причинам. Во-первых, эти методы не позволяют регистрировать генные мутации, которые возникают значительно чаще хромосомных. Во вторых, хромосомные мутации выявляются, как правило на фоне высокой митотической активности меристематических клеток. Повышенная токсичность факторов среды может вызывать снижение количества делящихся клеток за счёт задержки клеточного цикла в точках контроля, либо гибели части клеток, следовательно при этом искусственно снизится и частота регистрируемых хромосомных повреждений.

Точки контроля клеточного цикла (checkpoints) представляют собой периоды цикла, где происходит проверка точности выполнения предыдущей стадии. Такой механиз предохраняет делящиеся клетки от летального митоза, останавливая деление и давая время системе репарации для восстановления повреждений ДНК. Когда контролирующий механизм обнаруживает повреждённую или не реплицированную ДНК происходит задержка в клеточном цикле, в течение которого происходит корректировка. Точками контроля являются переходы G1-S и G2-M. Существует также особая точка контроля при переходе от метафазы в анафазу. Увеличение количества нарушений при воздействии генотоксикантов приводит к задержке клеточного цикла в точках контроля, что отражается на количестве делящихся клеток и на продолжительности фаз клеточного цикла.

Как следствие, для уменьшения возможных ложноотрицательных ответов при выявлении генотоксических и канцерогенных факторов удобно использовать такой показатель как митозмодифицирующая активность изучаемого фактора, которая определяется по уровню митотической активности ткани и относительной длительности фаз митоза. Исследование митозмодифицирующей активности позволяет выявить ранние изменения цитогенетической системы организма, вызванные комплексом различных нарушений.

Митозмодифицирующий эффект в меристеме корня растений исследуется параллельно с определением частоты хромосомных аберраций. Следовательно, в одном тесте можно зарегистрировать широкий спектр нарушений генетических структур и генетических процессов, что упрощает исследование и уменьшает затраты на его проведение.

Таким образом использование растительной тест-системы позволяет не только сказать о количественном воздействии изучаемого факторы на живой объект, но и определить характер воздействия по поражаемым участкам генетического материала.

Методика проведения тестирования

Подготовка оборудования для тестирования

Химические реактивы

Ацетоорсеин	1 г орсеина растворяют в 50 мл горячей уксусной кислоты, доводят до кипения и фильтруют. Используется для окраски корешков
Фиксатор Кларка	смесь 96 % этилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1

Подготовка материала для тестирования

Подготовка луковиц

Выберите луковицы для исследования. Выборка должна быть однородной как в контрольном, так и в опытном вариантах опыта. Средняя масса севка — 10-20г. Выбранные луковицы не должны быть пересушены. Это можно понять сняв лишнюю шелуху, которая так же может мешать и проведению опыта.

Подготовка фактора мутагенеза

Для тестирования подходят факторы различной природы (см. таблицу):

Физический мутаген:	Радиоактивное излучение Ультрафиолетовое излучение Инфракрасное излучение: Температура Радиоизлучение: Излучение мобильного телефона УВЧ излучение	В случае с физическим мутагенным фактором луковицы подвергаются воздействию фактора с прочими одинаковыми условиям среды, как в контроле
Химический мутаген:	Различные химические соединения или растворы веществ	В случае с химическим мутагенным фактором луковицы проращиваются на растворе или концентрированном растворе химического вещества и воды в заведомо определённой концентрации. Контроль проращивается на воде без добавления химического мутагенного фактора

Для чистоты эксперимента допустимо использование дистиллированной воды. При этом луковица будет расти за счёт внутренних питательных резервов. Ограничение тут в том, что дистиллированная вода является мутагеном. Однако и в контроле, и в опыте в этом случае ущерб от дистиллированной воды будем считать равным, как и прочие фоновые условия.
Луковицы проращиваются от 3 до 5 дней, пока корешки не упираются в дно ёмкости, в которой они находятся. Это может приводить к некоторым биологическим эффектам - реакция меристемы на препятствие ???...Для проведения анализа на стадии анафазы обычно фиксируют корешки длиной около 1 см, когда наблюдаются первые митозы в меристеме. При дальнейшем проращивании, в последующих митозах, аберрации хромосом можно наблюдать в виде микроядер на стадии интерфазы.

Проведение тестирования

Окраску корешков производят 2 % ацетоорсеином.

Статистика

Условные обозначения, расчёт митотического и фазных индексов

Расчёт митотических индексов можно проводить на тех же препаратах, что и ана-телофазный анализ. Просматривается от 400 до 600 клеток (больше — лучше). Подсчитывается общее количество делящихся клеток и отдельно клетки на разных стадиях митоза. На стадии ана- телофазы регистрируются нарушения митотического веретена (веретена деления):

• отставания хромосом,
• аберрантные митозы:
  • трёхполюсные митозы,
  • четырёхполюсные митозы,
  • несимметричные митозы.

Обозначение фазы / индекса	Свойства	Расчёт индекса
/ MI	митотический (mitotic) индекс (MI, %) Митотический индекс — процент делящихся клеток от общего числа проанализированных клеток.	${\mbox{MitoticI}}={\frac {\mbox{(P+M+A+T)}}{\mbox{N}}}*100\%$ , где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а N — общее число проанализированных клеток.
П / ПИ	профаза (prophase) ПИ% — профазный индекс Профазный индекс — процент клеток в профазе митоза от общего числа проанализированных клеток	${\mbox{PI}}={\frac {\mbox{P}}{\mbox{(P+M+A+T)}}}*100\%$ , где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а P — количество профаз в просчитанных клетках
М / МИ	метафаза (metaphase) МИ% — метафазный индекс Метафазный индекс — процент клеток в метафазе митоза от общего числа проанализированных клеток	${\mbox{MetaphaseI}}={\frac {\mbox{M}}{\mbox{(P+M+A+T)}}}*100\%$ , где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а M — количество метафаз в просчитанных клетках
А / АИ	анафаза (anaphase) АИ% — анафазный индекс Анафазный индекс — процент клеток в анафазе митоза от общего числа проанализированных клеток	${\mbox{AI}}={\frac {\mbox{(A)}}{\mbox{(P+M+A+T)}}}*100\%$ , где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а А — количество анафаз в просчитанных клетках
Т / ТИ	телофаза (telophase) ТИ% — телофазный индекс Телофазный индекс — процент клеток в телофазе митоза от общего числа проанализированных клеток	${\mbox{TI}}={\frac {\mbox{(T)}}{\mbox{(P+M+A+T)}}}*100\%$ , где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а Т — количество телофаз в просчитанных клетках
А-Т / А-ТИ	ана- телофаза А-ТИ% — ана- телофазный индекс Ана- телофазный индекс — процент клеток в анафазе и телофазе митоза от общего числа проанализированных клеток	${\mbox{A-TI}}={\frac {\mbox{(A+T)}}{\mbox{(P+M+A+T)}}}*100\%$ , где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а А+Т — количество ана- и телофаз в просчитанных клетках

Источники информации

Ссылки

Fiskesjö, Geirid. Биотестирование с помощью лука обыкновенного (рус.) = Protocol № 8. Allium test. — Швеция: Институт генетики Лундского университета, сентябрь 1989.