Конфокальная микроскопия

Лабораторный макет конфокального лазерного сканирующего микроскопа

Конфокальная микроскопия — чаще всего Конфокальная Лазерная Сканирующая Микроскопия (КЛСМ, Confocal laser scanning microscopy, CLSM) представляет собой разновидность оптической микроскопии, обладающий значительным контрастом и пространственным разрешением по сравнению со световой микроскопией, что достигается использованием апертуры, размещённой в плоскости изображения и ограничивающей поток фонового рассеянного света излучаемого не из фокальной плоскости объектива.. Это позволяет реконструировать трехмерное изображение из серий изображений, полученных на разных глубинах фокальной плоскости внутри образца (оптическое сканирование образца по глубине). Конфокальная микроскопия получила широкое применение в области биологии, медицины, материаловедения, физике полупроводников и спинтронике (в частности, в изучении свойств NV-центров).

История развития КЛСМ

Первые прототипы: 1940 - 1957

В 1940 году Ганс Гольдманн, офтальмолог из Берна, Швейцария, разработал систему щелевых ламп для документирования глазных обследований . Эта система рассматривается некоторыми более поздними авторами в качестве первой конфокальной оптической системы.

В 1943 году Зюн Коана опубликовала конфокальную систему. В 1951 году Хирото Наора, коллега Коаны, описал конфокальный микроскоп в журнале Science для спектрофотометрии.

В 1950-х годах биологам понадобилось увеличить контраст наблюдения помеченых флюорохромами объектов в толстых срезах тканей. Для разрешения этой проблемы Марвин Минский, профессор Массачусетского технологического института в США, предложил использовать для флуоресцентных микроскопов конфокальную схему. В 1961 г. Минский получил на эту схему патент.

Тандем-сканирующий микроскоп: 1958 - 1969

В 1960-х годах чехословацкий ученый Моймир Петраш из медицинского факультета Карловского университета в Пльзё разработал Тандем-сканирующий микроскоп, первый коммерческий конфокальный микроскоп, в конструкции которого использовался вращающийся диск Нипкова для создания и локализации очагов возбуждения и излучения.

Чехословацкий патент был подан в 1966 году Петрахом и коллегой из Чехословакии Миланом Хадравским. Первая научная публикация с данными и изображениями, полученными с помощью этого микроскопа, была опубликована в журнале Science в 1967 году, автором которого является Дэвид Эггер из Йельского университета и Петраша. Вторая публикация 1968 года описывает теорию и технические детали прибора. В 1970 году был выдан патент США, который был подан в 1967 году.

Совмещение конфокального микроскопа с лазерным осветителем: 1969 - 1977

В 1969 и 1971 гг. М. Дэвид Эггер и Пол Давидович из Йельского университета опубликовали пионерские работы, описывающие первый конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Это был точечный сканер, то есть генерировалось только одно пятно освещения. Он использовал эпи-подсветку в отраженном свете для наблюдения нервной ткани. 5 мВт гелий-неоновый лазер с длиной волны 633 нм отражался полупрозрачным зеркалом в направлении микрообъектива. Объективом являлась простая линза с фокусным расстоянием 8,5 мм. В противовес всем ранним и наиболее поздним системам образец сканировался движением этой линзы (объективное сканирование), что приводило к перемещению фокальной точки. Отраженный свет возвращался в полупрозрачное зеркало,  фокусировался другой линзой на диафрагму, позади которой размещался фотоэлектронный умножитель. Сигнал визуализировался с помощью ЭЛТ осциллографа, катодный луч перемещался одновременно с объективом. С помощью специального адаптера, предусматривалась возможность делать фотографии на фотоаппарат Polaroid, три из которых были опубликованы в работе 1971 года.

В результате, получили свое развитие схемы конфокального сканирующего микроскопа, оптические схемы которых сочетали лазерное излучение и принцип получения конфокального изображения Марвина Мински. В дальнейшем основное внимание исследований было направлено на анализ применения флуоресцентных красителей для исследований in vivo и улучшению качества конфокального изображения за счет увеличения интенсивности флуоресцирующего излучения. 

Развитие систем сканирования: 1977 – 1985

В 1977 году Колин Дж. Р. Шеппард и Амаржиоти Чоудхури, Оксфорд, Великобритания, опубликовали теоретический анализ конфокальных и лазерно-сканирующих микроскопов. Вероятно, это первая публикация, использующая термин «конфокальный микроскоп». В 1978 году Кристоф Кремер и Томас Кремер опубликовали проект конфокального лазерного сканирующего микроскопа с использованием флуоресцентного возбуждения с электронным автофокусом. В этой модели КЛСМ впервые был применен метод лазерного сканирования с объемным сканированием биологических объектов, помеченных флуоресцентными маркерами. В 1978 и 1980 годах Оксфордская группа вокруг Колина Шеппарда и Тони Уилсона описала конфокальную систему с эпи-лазерной подсветкой, сканирующим столиком образцов и фотоумножителями в качестве детекторов. Столик мог перемещаться вдоль оптической оси, что позволяло проводить 3D оптическую реконструкцию объекта исследования. В 1979 году Фред Бракенхофф и его коллеги продемонстрировали, что теоретические преимущества оптического секционирования и улучшения оптического разрешения действительно достижимы на практике. В 1983 году И. Кокс и Ш. Шеппард опубликовали первую работу, в которой конфокальный микроскоп управлялся персональным компьютером.

Сканирование лазерным пучком: 1985 - 2017

В середине 1980-х годов Уильям Брэдшоу Амос и Джон Грэлхем Уайт и его коллеги из Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже построили первый конфокальный сканирующий микроскоп. В его оптической схеме сканирование образца осуществлялось путем последовательного перемещения пучка освещения по образцу, а не движением столика с образцом. Данная схема позволила значительно увеличить скорость сканирования за счет отказа от инерционных механических систем сканирования и достичь быстродействия четыре кадра в секунду (512 строк в каждом). 

Параллельно, совет медицинских исследований (MRC) Великобритании, спонсировал разработку прототипа коммерческого КЛСМ, который в дальнейшем был приобретен Bio-Rad, дополнен компьютерным управлением и коммерциализирован как «MRC 500». Преемник MRC 600 позднее стал основой для разработки первого двухфотонно-флуоресцентного микроскопа, разработанного в 1990 году в Корнельском университете.

Исследования, проводимые в Стокгольмском университете примерно в то же время также трансформировались в коммерческий КЛСМ Sarastro.

Предприятие было приобретено в 1990 году Molecular Dynamics, но разработка КЛСМ в конечном итоге была прекращена.

В 1989 году Fritz Karl Preikschat и Ekhard Preikschat изобрели сканирующий лазерный диодный микроскоп для анализа размеров частиц.

В Германии компания Heidelberg Instruments, основанная в 1984 году, разработала технологию КЛСМ, которая первоначально предназначалась для промышленного применения, а не для биологии. В начале 1990-х гг данная методика активно развивалась в компаниях Leica Lasertechnik и Carl Zeiss, который на тот момент уже успешно осуществлял выпуск световых микроскопов с реализованной схемой сканирования лазерным пучком, которая в дальнейшем была модернизирована до конфокальной схемы.

Принцип работы

Оптическая схема обычного светового микроскопа формирует изображение всей части образца, находящегося в ГРИП используемого микрообъектива, а конфокальный микроскоп формирует изображения очень тонкого среза объекта по одному уровню его глубины за один раз. По сути, метод КЛСМ достигается за счет контролируемого ограничения глубины фокуса оптической системы. 

Принцип конфокальной визуализации был запатентован в 1957 году Марвином Минским и направлен на преодоление некоторых ограничений традиционных флуоресцентных микроскопов. В обычном флуоресцентном микроскопе весь образец равномерно освещается источником излучения микроскопа. При этом происходит одновременное возбуждение всего образца. Полученная в результате такого облучения флуоресценция детектируется с помощью фотоприемника или камеры микроскопа, включая большую фоновую часть. Напротив, конфокальный микроскоп использует точечную подсветку (см. Функция Размытия Точки, Point Spread Function) и отверстие в оптически сопряженной плоскости перед детектором для исключения внефокусного сигнала. Таким образом, происходит детектирование флуоресцирующего излучения, источник которого находится очень близко к фокальной плоскости, поэтому оптическое разрешение изображения, особенно в направлении Z (в глубину образца), намного лучше, чем у обычных световых микроскопов. Однако, поскольку большая часть света от образца флуоресценции диафрагмируется, увеличению разрешения сопутствует снижение интенсивности полезного сигнала. Для компенсации этого побочного эффекта используют более длительную экспозицию детектора и высокочувствительные фотоприемники, как правило ФЭУ или ЛПД (лавинно-пролетный фотодиод), которые преобразуют оптический сигнал в электрический, который записывается компьютером.

Поскольку на образце регистрируется только одна флуоресцирующая точка, то для формирования двумерного или трехмерного изображения требуется растровое сканирование образца. Пучок сканируется по образцу в горизонтальной плоскости с использованием одного или нескольких  зеркал с управляемым углом наклона. Этот метод сканирования обычно имеет низкую скорость сканирования, которая, однако, может варьироваться. Так, более медленное сканирование обеспечивает лучшее соотношение сигнал / шум, что приводит к лучшему контрасту и более высокому разрешению.

Как известно, ГРИП КЛСМ прямо пропорциональна длине волны используемого излучения и обратно пропорциональна числовой апертуре микрообъектива, а также зависит от оптических свойств образца. Благодаря этому в КЛСМ с помощью различных алгоритмов происходит программная реконструкция точки. 3D- объектов. Наиболее распространенным является алгоритм поиска максимума интенсивности.

Схема конфокального микроскопа. Рассеянный свет, идущий из глубины образца (пунктирные линии синего цвета), отрезаются апертурами, что обеспечивает высокий контраст изображения

Конфокальный микроскоп имеет разрешение $\delta$ такое же как и обычный микроскоп и ограничено оно дифракционным пределом.

$\delta ={\frac {\lambda }{\pi (NA)}}$

где $\lambda$ — длина волны излучения, $(NA)=n\sin \alpha$ — числовая апертура объектива, $n$ — показатель преломления среды между образцом и объективом, $\alpha$ — половина угла, который «захватывает» объектив. В видимом диапазоне разрешение составляет ~ 250 нм (NA=1,45, n=1,51). Однако в последние годы успешно развиваются схемы микроскопов, которые используют нелинейные свойства флуоресценции образцов. В этом случае достигается разрешение значительно меньшее дифракционного предела и составляет ~ 3—10 нм .

Рассмотрим теперь вопрос увеличения контрастности при использовании конфокальной оптической схемы. Во-первых, так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки (далее обозначаемая PSF) имеет следующий вид:

$Pconf(\xi ,\rho )=p(\xi ,\rho )\times p(\xi ,\rho )$, где

Pconf - конфокальная функция размытия точки, а p - обычная функция размытия точки.

Конфокальная микроскопия обеспечивает возможность прямого, неинвазивного последовательного оптического секционирования неповрежденных протяженных вдоль оптической оси живых образцов с минимальными требованиями к их подготовке, а также более высокое латеральное разрешение в сравнении с обычной световой микроскопией . Как правило, биологические образцы контрастируют флуоресцентными красителями, чтобы визуализировать их определенные области или органеллы. При этом фактическая концентрация красителя может быть очень низкой, чтобы свести к минимуму воздействие на биологические системы. Так, некоторые КЛСМ могут отслеживать отдельные флуоресцентные молекулы. Кроме того, трансгенные методы могут создавать организмы, которые продуцируют свои собственные флуоресцентные молекулы (такие GFP green fluorescent protein).

Показатель преломления биологических объектов почти такой же как у стекла, поэтому наблюдение этих объектов, находящихся на поверхности предметного стекла, в обычном микроскопе весьма затруднено. Конфокальный микроскоп, имеющий высокий контраст, даёт две неоценимые возможности: он позволяет исследовать ткани на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности, а также оценивать результаты исследования (то есть клеточной активности) в четырёх измерениях — высота, ширина, глубина и время.

Пространственное разрешение в конфокальной микроскопии

Функция размытия точки (PSF) в конфокальном микроскопе

Файл:Интенсивность флуоресцентного сигнала.jpg

Интенсивность флуоресцентного сигнала конфокального микроскопа

Применяя критерий Релея для разрешения (провал 26% от максимума распределения), то мы получим, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивается, но не существенно. Для конфокального микроскопа разрешение (r_c) определяется следующим образом[1]:

$r_{c}=0.44{\lambda \over n\cdot sin\Theta }=0.88{\lambda ' \over D}\cdot F$,

где n - относительный показатель преломления, D - диаметр входного зрачка оптической системы, λ - длина волны, F - фокусное расстояние микрообъектива, θ - апертурный угол микрообъектива, λ'=λ/n. Для обычного светового микроскопа разрешение (r_r):

$r_{c}=0.61{\lambda \over n\cdot sin\Theta }=1.22{\lambda ' \over D}\cdot F$

Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а существенное увеличение контрастности. В частности для обычной PSF в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде в центре составляет 2%, для случая конфокального микроскопа это отношение будет 0.04%. На рисунке приведен распределение интенсивностей. На верхней части рисунка мы видим, что тусклый объект (интенсивность в 200 раз меньше, чем у яркого) невозможно обнаружить в обычный световой микроскоп, хотя расстояние между объектами существенно больше определяемого критерием Релея для их разрешения. В то же самое время, методом конфокальной микроскопии данный объект хорошо регистрируется.

Конфокальная микроскопия обеспечивает увеличение контраста изображения за счет применения сфокусированной подсветки в области анализа и диафрагмирования излучения в плоскости наблюдения. Такое увеличение контрастности приводит к возможности разрешения объектов, имеющих разницу в интенсивности до 200:1, а также обеспечивает повышение разрешения, как в плоскости объекта, так и вдоль оптической оси. Наряду с повышением контрастности флуоресцентная конфокальная микроскопия позволяет обеспечивать пошаговую трехмерную реконструкцию исследуемого объекта за счет использования многочастотной подсветки. Среди наиболее передовых методик сканирующей конфокальной микроскопии следует выделить использование сканирующего диска с микродиафрагмами и применение матричных фотодетекторов [2].

На сегодня существуют методики, которые позволяют значительно повысить разрешающую способность конфокального микроскопа. В обычном конфокальном микроскопе возбуждающий свет фокусируется в одну точку на образце для дальнейшей детекции эмиссионного флуоресцентного сигнала. Эмиссионное излучение вне фокуса отсекается пинхолом (точечной диафрагмой), размер которого определят, сколько максимумов диска Эйри достигнет детектора. Увеличения разрешения можно добиться за счет уменьшения диаметра диафрагмы (пинхол апертуры), но соотношение «сигнал-шум» при этом значительно снизится, так как будет снижаться интенсивность проходящего через диафрагму эмиссионного излучения. Альтернативой сканирования пинхолл апертурой является использование матричных детекторов, которые одновременно регистрируют распределение интенсивности вдоль аксиальной плоскости образца одновременно со всей площади диска Эйри, где каждый фоточувствительный элемент выполняет функцию пинхол апертуры.  Так, с использованием алгоритма детекции 32-канальным матричным детектором (Airyscan), была  показана возможность превышение предела классического разрешения Рэлея более чем в 1,7 раза во всех трех измерениях (до 140 нм латерально и 400 нм аксиально при длине волны 488 нм. 

Применение

КЛСМ широко используется во многих отраслях биологии, от клеточной биологии и генетики до микробиологии и биологии развития. Он также используется в квантовой оптике и нанокристаллической визуализации и спектроскопии.

Биология и медицина

С точки зрения языка, КЛСМ используется для оценки различных заболеваний глаз, и особенно полезна для визуализации, качественного анализа и количественной оценки эндотелиальных клеток роговицы. Он используется для локализации и идентификации присутствия нитевидных грибковых элементов в строме роговицы в случаях кератомикоза, что позволяет быстро диагностировать и тем самым раннее введение окончательной терапии. Также представляется перспективным исследование методов КЛСМ для эндоскопических процедур (эндомикроскопия). В фармацевтической промышленности было рекомендовано следить за процессом производства тонкопленочных фармацевтических форм, контролировать качество и однородность распределения лекарств.

Оптика и кристаллография

КЛСМ используется как механизм поиска данных в некоторых 3D-оптических системах хранения данных и картировании химических соединений . 

Пример изображений полученных методом КЛСМ

Пример изображения в конфокальном микроскопе: β-тубулин в инфузории Tetrahymena

Конфокальное изображение сечения листа Pteridium aquilinum

См. также

• Флуоресцентная микроскопия
• Флуоресценция в биологических исследованиях

Ссылки

• Molecular Expressions: Laser Scanning Confocal Microscopy
• Nikon’s MicroscopyU. Comprehensive introduction to confocal microscopy.
• Emory’s Physics Department. Introduction to confocal microscopy and fluorescence.
• The Science Creative Quarterly’s overview of confocal microscopy — high res images also available.
• Programmable Array Microscope — Confocal Microscope Capabilities.
• OPTELICS HYBRID — многофункциональный световой конфокальный и лазерный конфокальный микроскоп .