Проточная цитометрия

Проточная цитометрия является современной технологией быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.

Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клеточной стенки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Образцы для проточной цитометрии

кровь
костный мозг
ликвор
суставная жидкость
плевральная жидкость
асциты
клетки тканей (например, опухолей)

Принцип метода

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).
рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а так же о неоднородности и гранулярности клеток).
интенсивность флуоресценции по 4-ем каналам флуоресцентности (позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.)

Наиболее часто используемые флуорохромы

флуоресцеина изотиоцианат (FITC)
Фикоэритрин (PE, RD1)
Перидинин-Хлорофилл Протеин (Per-CP)
Алофикоцианин (APC)

Тандемные красители:

Фикоэритрин - Техасский красный (ECD)
Фикоэритрин - Cy5 (PC5)
Фикоэритрин - Cy7 (PC7)

Преимущества метода

короткое время анализа (сек) за счет высокой скорости
анализ большого количества клеток (до 10⁷ клеток)
логические ограничения допускают детектирование субпопуляций клеток
измерение параметров редко встречающихся клеток
объективное измерение интенсивности флуоресценции

Область применения

Иммунология

иммунофенотипирование клеток периферической крови
исследование иммунного статуса
определение фагоцитарной активности
определение внутриклеточных цитокинов

Онкология

количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК)
анализ стадий клеточного цикла
выявление ануплоидного клона
определение пролиферативной активности ануплоидного клона
определение специфических маркеров
позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска

Цитология

определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
определение экспрессии поверхностных антигенов
анализ стадий клеточного цикла
измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca²⁺, потенциал наружной клеточной мембраны)

Гематология

анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови
подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам

Фармакология

измерение экспрессии маркеров
измерение активности внутриклеточных ферментов
определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100—1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов (отношение CD4+/CD8+). Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.

Ссылки

Центра цитометрии Университета Пурдю (Индиана, США) http://www.cyto.purdue.edu
http://www.probes.com

Литература

Davey H. Flow cytometry for clinical microbiology. CLI 2004; 2/3:12-5.
Shapiro H.M. "Practical Flow Cytometry", Alan Liss, .N.Y., 1985.

--Rudik D. 14:02, 22 февраля 2009 (UTC)

Проточная цитометрия

Содержание