Проточная цитометрия

Схема оборудования для проведения проточной цитометрии.

Проточная цитометрия — метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции. Название метода связано с основным приложением, а именно, с исследованием одиночных биологических клеток в потоке.

Основа метода заключается в 1) использовании системы гидрофокусировки, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке; 2) облучении клетки лазерным излучением; 3) регистрации сигналов светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки.

Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Образцы

• кровь
• костный мозг
• ликвор
• суставная жидкость
• плевральная жидкость
• асцитическая жидкость
• суспензированные клетки тканей (например, опухолей)

Принцип

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

• рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).
• рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).
• интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.

Флуорохромы

• Флуоресцеина изотиоцианат (FITC)
• Фикоэритрин (PE, RD1)
• Перидинин-Хлорофилл Протеин (Per-CP)
• Алофикоцианин (APC)

Тандемные красители:

• Фикоэритрин — Техасский красный (ECD)
• Фикоэритрин — Cy5 (PC5)
• Фикоэритрин — Cy7 (PC7)
• Аллофикоцианин- Cy7 (APC-Cy7)

«Квантовые точки» QD560, QD590 и т. д.

Преимущества

• короткое время анализа за счет высокой скорости (до 100 000 событий в секунду)
• анализ большого количества клеток (до 10⁸ клеток в мл)
• определение субпопуляций клеток
• измерение параметров редко встречающихся клеток
• объективное измерение интенсивности флуоресценции

Применение

Иммунология

• иммунофенотипирование клеток периферической крови
• определение фагоцитарной активности (захват меченных флюорохромами бактерий или дрожжей)
• определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная продукция и под действием различных специфических или неспецифических активаторов, таких как ФМА + иономицин, ЛПС, ФНО-альфа)
• определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
• определение пролиферативной активности (выявление инкорпорированого бромдезоксиуридина)
• исследование клеточного цикла
• оценка клеточной цитотоксичности

Онкология

• количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК)
• анализ стадий клеточного цикла
• выявление анеуплоидного клона
• определение пролиферативной активности анеуплоидного клона
• определение специфических маркеров
• позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска
• оценка состояния иммунной системы:
• оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов)
• оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т. п.)

Цитология

• определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
• оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
• определение экспрессии поверхностных антигенов
• анализ стадий клеточного цикла
• измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca²⁺, потенциал наружной клеточной мембраны)

Гематология

• анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови
• подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам
• дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов
• диагностика лимфопролиферативных заболеваний
• диагностика острых лейкозов
• оценка минимальной резидуальной болезни

Фармакология

• измерение экспрессии маркеров
• измерение активности внутриклеточных ферментов
• определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне

Растениеводство / Сельское хозяйство

• определение плоидности клеток
• анализ клеточного цикла
• анализ и сортировка протопластов

Литература

1. Davey H. Flow cytometry for clinical microbiology. CLI 2004; 2/3:12-5.
2. Shapiro H.M. «Practical Flow Cytometry», Alan Liss, .N.Y., 1985.