「比较基因组杂交」：修訂間差異
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'''比较基因组杂交（Comparative genomic hybridization）'''是一种分子细胞遗传学方法，在不培养细胞的情况下，分析相对于参照样品，测试样品的DNA中拷贝数变异（CNV）的多倍性程度。其目的是快速有效地比较两个来源的两组DNA样本，这两组DNA通常是密切相关的，因为两者在整个染色体或亚染色体区域（整个染色体的一部分）上都可能有获得或丢失。该技术最初是为了评估实体瘤和正常组织的染色体互补差异而开发的，[1]相比更传统的Giemsa显带技术和荧光原位杂交技术（FISH）（受限于所使用的显微镜分辨率），它的分辨率提高到了5-10Mb。<sup>[2][3]</sup> |
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'''比较基因组杂交'''（{{lang-en|Comparative genomic hybridization}}，'''CGH'''）是一种分子[[细胞遗传学]]方法，可以在不培养[[细胞]]的情况下分析得到被测样本相对于对照样本的DNA{{link-en|拷贝数变异|Copy-number variation}}（CNV）倍数水平。这项技术的目的是快速有效地比较不同来源的两个通常密切相关的染色体DNA样本。密切相关是因为两份样本在整个[[染色体]]或亚染色体区（整个染色体的一部分）上都可能有获得或丢失，因此怀疑它们含有不同之处。而该技术最初是为了评估实体瘤和正常组织的染色体互补差异而开发的<ref name="Kallioniemi,Kallioniemi,Sudar,Rutovitz,Gray,Waldman,Pinkel">{{cite journal | vauthors = Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar DA, Rutovitz D, Gray JW, Waldman F, Pinkel D | year = 1992 | title = Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors | url = | journal = Science | volume = 258 | issue = 5083| pages = 818–821 | doi=10.1126/science.1359641}}</ref>，相比更传统的[[G显带]]技术和[[荧光原位杂交]]技术（FISH）（受限于[[显微镜]]分辨率），它的分辨率提高了5-10Mb<ref name="Kallioniemi,Kallioniemi,Sudar,Rutovitz,Gray,Waldman,Pinkel">{{cite journal | vauthors = Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar DA, Rutovitz D, Gray JW, Waldman F, Pinkel D | year = 1992 | title = Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors | url = | journal = Science | volume = 258 | issue = 5083| pages = 818–821 | doi=10.1126/science.1359641}}</ref><ref name="Strachan">Strachan T, Read AP (2010) Human Molecular Genetics: Garland Science.</ref><ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest">Weiss M, Hermsen M, Meijer G, Van Grieken N, Baak J, Kuipers E, Van Diest P (1999) Comparative genomic hybridization. Molecular Pathology 52:243–251.</ref>。此技术是通过竞争性荧光原位杂交来实现的。简而言之，从待比较的两个样品中分离DNA，通常一个用作检测组另一个用作对照组，用不同颜色（通常是红色和绿色）的荧光分子分别标记两个DNA样品，变性DNA使其成为单链，再将两组的1:1混合物与正常的细胞分裂[[有絲分裂#中期|中期]]染色体进行杂交，并且结合在原位。然后使用荧光显微镜和计算机软件，纵向比较杂交染色体荧光信号的着色差异，以鉴别两个样品的染色体差异。杂交染色体特定区域中的测试样品颜色较强，表示测试样品中该区域有获得，而参照样品颜色较强表示测试样品中有丢失。中性色（黄色，当同时标记红色和绿色）则表示两个样品在该区域没有差异<ref name="Strachan" /><ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest" />。 |
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CGH只能检测不平衡的[[染色体畸变|染色体异常]]，这是因为平衡的染色体异常（例如易位、倒位或环状染色体）不影响拷贝数。但CGH的確能够在单次测试中探测全部46条人类染色体，并且可以发现缺失和重复，甚至在微观尺度上，能够再用其他细胞学技术进一步鉴定候选基因<ref name="Strachan" /><ref>[3]</ref>。 |
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这项技术是通过竞争性荧光原位杂交实现的。简言之，从待比较的两个样品（通常是测试和参照样品）中分离DNA，用不同颜色（通常是红色和绿色）的荧光团（荧光分子）分别标记两组DNA样品，变性DNA使其成为单链，再将两组的1：1混合物与正常中期染色体进行杂交，并且结合在原位。然后使用荧光显微镜和计算机软件，纵向比较杂交染色体荧光信号的着色差异，以鉴别两组的染色体差异。杂交染色体特定区域中的测试样品颜色较强，表示测试样品中该区域有获得，而参照样品颜色较强表示测试样品中有丢失。中性色（黄色，当同时标记红色和绿色）则表示两个样品在该区域没有差异。<sup>[2][3]</sup> |
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通过结合CGH技术和[[DNA微阵列]]，已经开发出更特效的阵列CGH（aCGH），可以逐点检测CNV，分辨率精确到100kb（千[[碱基对|碱基]]）<ref name="Pinkel,Albertson">Pinkel D, Albertson DG (2005) Comparative genomic hybridization. Annu Rev Genom Hum Genet 6:331–354.</ref><ref name="deRavel,Devriendt,Fryns,Vermeesch">de Ravel TJ, Devriendt K, Fryns J-P, Vermeesch JR (2007) What's new in karyotyping? The move towards array comparative genomic hybridization (CGH). European journal of pediatrics 166:637–643.</ref>。这种改进的技术可以使人们发现已知和未知的病因。 |
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CGH只能检测不平衡的染色体异常，这是因为平衡的染色体异常（例如易位、倒位或环状染色体）不影响拷贝数。不过CGH确实能够在单次测试中探测全部46条人类染色体，并且可以发现缺失和重复，甚至在微观尺度上，可以再用其他细胞学技术进一步鉴定候选基因。<sup>[2][4]</sup> |
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通过结合CGH技术和DNA微阵列，已经开发出更特效的阵列CGH（aCGH），它可以逐点检测CNV，分辨率精确到100kb。<sup>[5][6]</sup>这种改进的技术可以发现已知和未知的致病位点。 |
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==历史== |
==历史== |
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CGH |
发展CGH的动机：显微镜限制了当时可用的细胞遗传学分析技术（Giemsa显带和FISH）的分辨率。此外Giemsa显带解释模糊，准确性偏低，而且这两种技术都需要投入大量人力，这就对可检查位点造成了限制。[5] |
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CGH分析的第一份报告出自Kallioniemi及其同事（1992年， |
CGH分析的第一份报告出自Kallioniemi及其同事（1992年，加利福尼亚大学旧金山分校），内容关于实体肿瘤。他们将该技术直接应用于乳腺癌细胞系和原发性膀胱肿瘤，建立完整的细胞拷贝数核型，识别出了16个不同的扩增区域，其中许多是新发现的。[1] |
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1993年，du Manoir等人用几乎相同的方法，在DNA文库用不同比例的两种荧光团绘制了一系列单独的人类染色体，以此来测试该技术，并将CGH应用于 |
不久之后，在1993年，du Manoir等人用几乎相同的方法，在DNA文库用不同比例的两种荧光团绘制了一系列单独的人类染色体，以此来测试该技术，并将CGH应用于唐氏综合症、T幼淋巴细胞性白血病和肾乳头状癌患者的基因组DNA。结果所得的荧光比率是准确的，并且可检测到来自不同细胞类型的基因组DNA之间的差异，因此CGH是非常有效的细胞遗传学分析工具。[7] |
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最初 |
最初难以推广CGH技术，因为实验设计不统一而彼此不一致，特别是数据的解释不确定。[3]然而1994年发表的一篇综述详细描述了一个易于理解的实验设计，[8]并且图像分析软件可以商业化，这使得CGH在世界各地得到应用。[3]随着显微切割和简并寡核苷酸引物聚合酶链式反应（DOP-PCR）等新技术用于生成DNA产物，而有可能将CGH应用于更小的染色体异常，从而提高CGH的分辨率。[3] |
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1997年，Solinas-Tolodo等人开创了阵列CGH，使用DNA微阵列代替传统的中期染色体制剂，来分析肿瘤细胞 |
1997年，Solinas-Tolodo等人开创了阵列CGH，使用DNA微阵列代替传统的中期染色体制剂，来分析肿瘤细胞。[9]1998年，Pinkel等人则用其来分析乳腺癌细胞。[10]以上都是借助人类基因组计划实现的，该计划创造了一个DNA克隆片段文库，包括整个人类基因组的已知位点，而这些片段被用作DNA微阵列上的探针。[11]现在各种来源的探针，如cDNA、基因组PCR产物和细菌人工染色体（BACs）可用于DNA微阵列，总计可达200万个探针。[11]阵列CGH是自动化的，因为探针远小于中期染色体，所以比传统CGH有更高的分辨率（精确至100kb），需要的DNA数量较小，还可以根据需要定位到特定的染色体区域，甚至可以定制，因此分析速度更快，更适用于诊断。<sup>[11][12]</sup> |
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==基本方法== |
==基本方法== |
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'''中期载玻片制备''' |
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从核型正常的男性或女性取得载玻片上的参照样品DNA，优先使用女性DNA，因为它们具有两条[[X染色体]]，其含有比男性[[Y染色体]]更多的遗传信息。使用{{link-en|植物血凝素|Phytohaemagglutinin}}刺激外周血中的淋巴细胞。将1ml[[肝素]]化血液加入10ml培养基中，并在37℃、5%CO<sub>2</sub>环境下培养72小时。加入[[秋水仙碱]]来中止有丝分裂，然后分离出细胞并用低渗[[氯化钾]]处理并固定在3：1的[[甲醇]]/[[乙酸]]中<ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest" />，然后将一滴细胞悬浮液从约30cm的高度滴到用[[乙醇]]清洁过的[[玻璃片|载玻片]]上，最佳条件为室温、湿度60～70%。使用[[相衬显微技术|相差显微镜]]可视化地评估载玻片，应观察到最小的[[细胞质]]，染色体不能重叠，应该为400～550个条带，并且没有分离的染色单体，最后应显示为深暗色而不具有光泽。之后将载玻片在室温空气下过夜干燥，再以四个为一组储存在-20℃下，并用二氧化硅珠或氮以保持干燥。应测试不同的供体，因为杂交可能是变化的。可以使用市售的载玻片，但应始终首先进行测试<ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest" />。 |
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从核型正常的男性或女性获得参照样品DNA，置于载玻片上，优先使用女性DNA，因为它们具有两条X染色体，其含有比男性Y染色体更多的遗传信息。使用植物血凝素刺激外周血中的淋巴细胞。将1ml肝素化血液加入10ml培养基中，并在37℃、5%CO<sub>2</sub>环境下培养72小时。加入秋水仙碱中止细胞的有丝分裂，然后分离出细胞并用低渗氯化钾处理，固定在3：1的甲醇/乙酸中。[3] |
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===从测试组织和参照组织中分离DNA=== |
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用标准[[苯酚]]萃取物从测试或参照（核型正常个体）组织获得DNA，其涉及Tris-乙二胺四乙酸和苯酚与等量的DNA水溶液的混合。然后通过搅拌和离心来分离混合液，之后除去水层并用乙醚进一步处理，最后用乙醇沉淀浓缩DNA<ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest" />，可以使用基于亲和柱的商品DNA分离试剂盒完成<ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest" />。 |
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然后将一滴细胞悬浮液从约30cm的高度滴到用乙醇清洁过的载玻片上，最佳条件为室温、湿度60-70%。使用相差显微镜可视化地评估载玻片，应观察到最小的细胞质，染色体不能重叠，应该为400-550个条带，并且没有分离的染色单体，最后应显示为深色而不具有光泽。之后将载玻片在室温空气下过夜干燥，再以四个为一组储存在-20℃下，并用二氧化硅珠或氮以保持干燥。应测试不同的供体，因为杂交是可变的。可以使用市售的载玻片，但始终应先进行测试。[3] |
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最优选的是从新鲜或冷冻组织中提取DNA，因为这样的质量最高，不过只要遵循适当的程序，现在也可以使用福尔马林固定或石蜡包埋的库存样品。对于CGH实验，0.5-1μg的DNA為足夠的量，如果量不够，可以使用DOP-PCR来扩增DNA，但是在这种情况下，需要用DOP-PCR同时扩增测试和参照DNA样品以提高可靠性<ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest" />。 |
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'''从测试组织和参照组织中分离DNA''' |
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===DNA标记=== |
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用缺口转译标记DNA，切割DNA，并用[[荧光团]]、[[生物素]]或[[氧化苦苷]]标记的核苷酸（直接标记）替代后加入的缀合荧光团的抗体（间接标记）。之后重要的一步是通过凝胶[[电泳]]检查测试和参照DNA的片段长度，它们在500kb-1500kb范围内杂交最佳<ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest" />。 |
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用标准苯酚萃取物从测试或参照（核型正常个体）组织提取DNA，其需要三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）和苯酚与等量的DNA水溶液的混合。然后通过搅拌和离心来分离混合液，之后除去水层并用乙醚进一步处理，最后用乙醇沉淀浓缩DNA。[3] |
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===阻断=== |
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添加未标记的Life Technologies Corporation的Cot-1DNA®（富含长度为50bp-100bp的重复序列的胎盘DNA）以阻断正常的DNA序列重复，特别是在着丝粒和端粒，因为如果检测到这些序列，可能会降低荧光比率和漏测获得或丢失<ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest" />。 |
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也可以使用基于亲和层析柱的商品DNA分离试剂盒来完成。[3] |
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最优的是从新鲜或冷冻组织中提取DNA，因为这样的质量最高，不过只要遵照适当的程序，现在也可以使用福尔马林固定或石蜡包埋的库存样品。对于CGH实验，0.5-1μg的DNA就足够了，如果量不够，可以使用DOP-PCR来扩增DNA，但是在这种情况下，需要同时扩增测试和参照样品以提高准确性。[3] |
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'''DNA标记''' |
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用缺口转译标记DNA，切割DNA，并用荧光团（直接标记）、生物素或氧化苦苷标记的核苷酸替代后加入的缀合荧光团的抗体（间接标记）。随后重要的一步是通过凝胶电泳检查测试和参照DNA片段的长度，500kb-1500kb是最佳杂交范围。[3] |
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'''阻断''' |
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添加未标记的Life Technologies Corporation的Cot-1DNA®（富含长度为50bp-100bp的重复序列的胎盘DNA）以阻断正常的DNA序列重复，特别是在着丝粒和端粒，因为如果检测到这些序列，可能会降低荧光比率和漏测获得或丢失。[3] |
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'''杂交''' |
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将8-12μl标记测试DNA和等量的标记参照DNA混合，加入40μg Cot-1DNA®，然后沉淀，随后溶于6μl杂交混合液中，其含有50%甲酰胺（降低DNA解链温度）和10%硫酸葡聚糖（增加pH7.0的标准枸橼酸盐水（SSC）溶液中的有效探针浓度）。[3] |
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===杂交=== |
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将8-12μl标记测试DNA和等量的标记参照DNA混合，加入40μg Cot-1DNA®，然后沉淀，随后溶于6μl杂交混合液中，其含有50%[[甲酰胺]]（降低DNA解链温度）和10%[[硫酸葡聚糖]]（增加pH7.0的标准[[枸橼酸]]盐水（SSC）溶液中的有效探针浓度）<ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest" />。 |
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分别进行载玻片和探针的变性。将载玻片在72℃的70%甲酰胺/2×SSC中浸没5-10分钟，同时80℃水浴探针10分钟，并立即加入中期载玻片制备中。然后用盖玻片覆盖该反应，放置在40℃的潮湿房中2至4天。[3] |
分别进行载玻片和探针的变性。将载玻片在72℃的70%甲酰胺/2×SSC中浸没5-10分钟，同时80℃水浴探针10分钟，并立即加入中期载玻片制备中。然后用盖玻片覆盖该反应，放置在40℃的潮湿房中2至4天。[3] |
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然后除去盖玻片并多次洗涤5分钟，3次在室温下使用2xSSC，1次在45℃下使用0.1xSSC，1次在室温下使用TNT。随后预育反应10分钟，再进行60分钟、37℃温育，用TNT洗涤3次，每次5分钟，之后在室温下用2×SSC洗涤1次。然后依次使用70%、96%、100%的乙醇干燥载玻片，再用DAPI（0.35μg/ml）复染，用于染色体鉴定，并用盖玻片密封<ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest" />。 |
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然后除去盖玻片并给予多次5分钟的洗涤，3次使用室温的2xSSC，1次使用45℃的0.1xSSC，1次使用室温的TNT。随后预反应10分钟，再进行60分钟、37℃温育，用TNT洗涤3次，每次5分钟，之后用室温的2×SSC洗涤1次。最后依次使用70%、96%、100%的乙醇干燥载玻片，再用DAPI（0.35μg/ml）复染，用于染色体鉴定，并用盖玻片密封。[3] |
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===荧光可视化和成像=== |
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可视化需要配备用于DAPI染色的适当[[过滤器]]的荧光显微镜，且需使用两种荧光团，并且这些过滤器还应最小化荧光团之间的串扰，[[窄带通过滤器]]就是合適的選擇之一。显微镜必须均匀照明而且没有色彩变化，可以适当校准并具有复消色差的“平面”类型的物镜，放大倍数为x63或x100<ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest" />。 |
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使用在样品水平上具有至少0.1μm空间分辨率的相机记录图像，并给出至少600x600像素的图像。相机还必须能够将图像整合至少5到10秒，最小光度分辨率为8bit<ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest" />。 |
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可用市售专门的CGH软件处理图像，需要减去背景噪声，去除和分割非染色体来源的材料，使荧光比率标准化，进行交互式核型分析和缩放染色体至标准长度。通过平均多个高质量中期的比率生成了，呈现缺失或扩增的染色体区域的“相对拷贝数核型”，并沿着染色体模式图（基于显带模式识别染色体）绘制它们。使用固定或统计[[阈值]]（置信区间）对比率概况进行解释，当95%的荧光比率不包含1.0时，识别出获得或丢失<ref name="Weiss,Hermsen,Meijer,VanGrieken,Baak,Kuipers,VanDiest" />。 |
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'''荧光可视化和成像''' |
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===额外说明=== |
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必须特别注意避免DNA的污染，特别是测试DNA，因为污染了正常DNA会使结果偏向而接近1.0，由此可能会检测不到变异。可以使用FISH、PCR和流式细胞计量术来验证结果<ref name="Pinkel,Albertson" /><ref name="Evangelidou,Alexandrou,Moutafi,Ioannides,Antonios,Koumbaris,Kallikas,Velissariou,Sismani,Patsalis">Evangelidou P, Alexandrou A, Moutafi M, Ioannides M, Antoniou P, Koumbaris G, Kallikas I, Velissariou V, Sismani C, Patsalis PC (2013) Implementation of High Resolution Whole Genome Array CGH in the Prenatal Clinical Setting: Advantages, Challenges, and Review of the Literature. BioMed Research International 2013.</ref>。 |
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可视化需要：装备针对DAPI染色的合适滤光镜的荧光显微镜，以及使用两种荧光团，并且这些滤光镜（例如窄带滤光镜）还应最小化荧光团之间的串扰。显微镜必须提供均匀照度而且没有色度变化，可以适当校准并具有复消色差的平面物镜，放大倍数为x63或x100。[3] |
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使用至少0.1μm空间分辨率的相机记录图像，像素至少600x600。相机还必须能够融合至少5到10秒的图像，其最小光度分辨率为8bit。[3] |
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可用市售的专门CGH软件处理图像，需要减去背景噪声，去除和分割非染色体来源的内容，使荧光比率标准化，进行交互式核型分析和缩放染色体至标准长度。通过平均多个高质量中期染色体的比率生成了—呈现缺失或扩增的染色体区域的“相对拷贝数核型”，并沿着染色体模式图（基于显带模式识别染色体）绘制它们。使用固定或统计阈值（置信区间）对比率概况进行解释，当95%的荧光比率不包含1.0时，认为有获得或丢失。[3] |
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'''额外说明''' |
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必须特别注意避免DNA的污染，特别是测试DNA，因为污染了正常DNA会使结果偏向而接近1.0，由此可能会检测不到异常。可以使用FISH、PCR和流式细胞计量术来验证结果。<sup>[5][13]</sup> |
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==阵列比较基因组杂交== |
==阵列比较基因组杂交== |
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[[File:Array-CGH protocol.svg|缩略图|图2. 阵列CGH实验设计]] |
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阵列比较基因组杂交（基于微阵列的比较基因组杂交，矩阵CGH，阵列CGH，aCGH）是一种分子细胞遗传学技术，用于在基因组范围内高分辨率地检测染色体拷贝数变化<ref>{{cite journal | vauthors = Pinkel D, Albertson DG | year = 2005 | title = Array comparative genomic hybridization and its applications in cancer | url = | journal = Nat Genet | volume = 37 | issue = | pages = 11–17 | doi=10.1038/ng1569}}</ref>。阵列CGH将患者的基因组与参照基因组进行比较，鉴定两个基因组之间的差异，并利用与传统CGH相同的竞争性荧光原位杂交原理来定位患者基因组失衡的区域。 |
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阵列比较基因组杂交（基于微阵列的比较基因组杂交，矩阵CGH，阵列CGH，aCGH）是一种分子细胞遗传学技术，能在基因组范围内高分辨率地检测染色体的拷贝数变化。<sup>[14]</sup> 阵列CGH将患者的基因组与参照基因组进行比较，鉴定两个基因组之间的差异，并利用与传统CGH相同的竞争性荧光原位杂交原理来定位患者基因组失衡的区域。 |
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阵列CGH |
阵列CGH克服了传统CGH的主要缺点—低分辨率。在阵列CGH中，中期染色体被DNA克隆片段（+100-200kb）取代，其中确切的染色体位点是已知的。这样可以更详细地检测畸变，而且可以将变化直接映射到基因组序列上。[15] |
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阵列CGH已被证明是一种特异、灵敏、快速和高通量的技术，与其他分析DNA拷贝数变化的方法相比具有相当大的优势，更适合应用于诊断。使用这种方法，可以检测到5-10kb水平的拷贝数变化<ref>{{cite journal|vauthors=Ren H, Francis W, Boys A, Chueh AC, Wong N, La P, Wong LH, Ryan J, Slater HR, Choo KH |title=BAC-based PCR fragment microarray: high-resolution detection of chromosomal deletion and duplication breakpoints |journal=Human Mutation |pmid=15832308 |doi=10.1002/humu.20164 |volume=25 |issue=5 |date=May 2005 |pages=476–82}}</ref>。截至2006年，高分辨率CGH（HR-CGH）阵列甚至能准确检测分辨率为200 bp的结构变异（SV）<ref>{{cite journal |vauthors=Urban AE, Korbel JO, Selzer R, Richmond T, Hacker A, Popescu GV, Cubells JF, Green R, Emanuel BS, Gerstein MB, Weissman SM, Snyder M |title=High-resolution mapping of DNA copy alterations in human chromosome 22 using high-density tiling oligonucleotide arrays |journal=Proc Natl Acad Sci U S A |date=21 March 2006 |volume=103 |issue=12 |pages=4534–4539 |pmid=16537408 |pmc=1450206 |doi=10.1073/pnas.0511340103}}</ref>。该方法能够识别新的复发性染色体变化，例如由于染色体畸变导致的癌症和先天缺陷的微缺失和重复。 |
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阵列CGH已被证明是一种特异、灵敏、快速和高通量的技术，与其他分析DNA拷贝数变化的方法相比具有相当大的优势，更适合应用于诊断。使用这种方法，可以检测到5-10kb水平的拷贝数变化。[16]截至2006年，高分辨率CGH（HR-CGH）阵列能以200 bp的分辨率准确检测结构变异（SV）。[17]该方法能够识别新的复发性染色体变化，例如由于染色体畸变导致的癌症和先天性缺陷的微缺失和重复。 |
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[[File:Array-CGH protocol.svg|right|thumb|阵列CGH实验设计（圖1）]] |
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===方法=== |
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阵列CGH基于与传统CGH相同的原理。在这两种技术中，用两种不同的荧光团对来自参照（或对照）样品的DNA和来自测试（或患者）样品的DNA进行差异标记，并用作与靶标核酸竞争性共杂交的探针。在传统的CGH中，靶标是参照的中期染色体。在阵列CGH中，这些靶标可以是克隆在多种载体（如BACs或[[质粒]]）、[[cDNA]]或[[寡核苷酸]]中的基因组片段<ref name="Bejjani,Shaffer">Bejjani BA, Shaffer LG (2006) Applications of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn 8:528–533.</ref>。 |
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'''方法''' |
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图1<ref name="Oostlander,Meijer,Ylstra" />是阵列CGH技术的示意图。用红色荧光团（Cyanine 5）标记来自待测样品的DNA，用绿色荧光团（Cyanine 3）标记参照样品DNA。将等量的两种DNA样品混合并共杂交至含有数千个均匀间隔的克隆DNA片段或寡核苷酸的DNA微阵列，其已在阵列上一式三份点样。杂交后，用数字成像系统捕获和量化每种杂交荧光团的相对荧光强度<ref name="Bejjani,Shaffer" />，得到的荧光强度比与测试和参照基因组中DNA序列的拷贝数比成比例。如果荧光染色体的强度在一个探针上相等，则认为患者基因组的该区域在测试和参照样品中具有等量的DNA；如果Cy3：Cy5比例发生变化，则表明该特定基因组区域的患者DNA有丢失或获得<ref>Shinawi M, Cheung SW (2008) The array CGH and its clinical applications. Drug Discovery Today 13:760–769.</ref>。 |
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阵列CGH基于与传统CGH相同的原理。在这两种技术中，用两种不同的荧光团对来自参照（或对照）样品的DNA和来自测试（或患者）样品的DNA进行差异标记，并用作与靶标核酸竞争性共杂交的探针。在传统CGH中，靶标是参照的中期染色体。在阵列CGH中，这些靶标可以是克隆在多种载体（如BACs或质粒）、cDNA或寡核苷酸中的基因组片段。[18] |
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===阵列CGH的技术方法=== |
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通过各种技术实现了阵列CGH，因此阵列CGH的一些优点和局限性取决于所选择的技术。最初的方法是插入大片段的克隆DNA（例如BACs）产生阵列。BACs的使用提供了足够强烈的信号来检测单拷贝变化并准确定位畸变边界。但分离的BACs克隆的初始DNA产量低，并且必需DNA扩增技术。这些技术包括连接介导的[[聚合酶链反应]]（PCR）、使用一组或几组引物的简并引物PCR，以及[[滚环扩增]]<ref>{{cite journal | vauthors = Fiegler H, Carr P, Douglas EJ, Burford DC, Hunt S, Scott CE, Smith J, Vetrie D, Gorman P, Tomlinson IP, Carter NP | year = 2003 | title = DNA microarrays for comparative genomic hybridization based on DOP-PCR amplification of BAC and PAC clones | url = | journal = Genes Chromosomes Cancer | volume = 36 | issue = 4| pages = 361–374 | doi=10.1002/gcc.10155}}</ref>。cDNA构建阵列也可使用，这些阵列具有高空间分辨率，但cDNA的数量受到染色体上编码基因的限制，且由于交叉杂交造成灵敏度很低<ref name="Oostlander,Meijer,Ylstra" />，导致无法在基因组范围内检测单拷贝变化<ref>{{cite journal | vauthors = Pollack JR, Perou CM, Alizadeh AA, Eisen MB, Pergamenschikov A, Williams CF, Jeffrey SS, Botstein D, Brown PO | year = 1999 | title = Genome-wide analysis of DNA copy number changes using cDNA microarrays | doi = 10.1038/12640 | journal = Nat Genet | volume = 23 | issue = | pages = 41–46 }}</ref>。最新的方法是用短寡核苷酸准确定位阵列。寡核苷酸的数量几乎是无限的，并且处理快速，经济有效和简单。寡核苷酸不具有检测单拷贝变化的灵敏度，但是在染色体上彼此相邻的寡核苷酸的比率的平均值可以补偿降低的灵敏度<ref>{{cite journal | vauthors = Carvalho B, Ouwerkerk E, Meijer GA, Ylstra B | year = 2004 | title = High resolution microarray comparative genomic hybridization analysis using spotted oligonucleotides | url = | journal = J Clin Pathol | volume = 57 | issue = | pages = 644–646 | doi=10.1136/jcp.2003.013029}}</ref>。也可以使用具有重叠探针的阵列，以便揭示特定的断点。 |
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图2.[15]是阵列CGH技术的概略示意图。用红色荧光团（Cyanine 5）标记来自待测样品的DNA，用绿色荧光团（Cyanine 3）标记参照样品DNA。将等量的两种DNA样品混合并共杂交至含有数千个均匀间隔的DNA克隆片段或寡核苷酸的DNA微阵列（一式三份点样到阵列上）。杂交后，用数字成像系统捕获和量化每种杂交荧光团的相对荧光强度。[18]得到的荧光强度比与测试和参照基因组中DNA序列的拷贝数比成比例。如果荧光染色体的强度在一个探针上相等，则认为患者基因组的该区域在测试和参照样品中具有等量的DNA；如果Cy3：Cy5比例发生改变，则表明该区域有丢失或获得。[19] |
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'''阵列CGH的技术方法''' |
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阵列CGH是通过各种技术实现的，因此它的优缺点取决于所选择的技术。最初的方法是插入大片段的克隆DNA（例如BACs）产生阵列。BACs的使用提供了足够强烈的信号来检测单拷贝变化并准确定位畸变边界。然而分离的BACs克隆的初期DNA产量低，必需DNA扩增技术。这些技术包括连接介导的聚合酶链反应（PCR），使用一组或几组引物的简并引物PCR，以及滚环扩增。<sup>[20]</sup>也可以使用cDNA构建阵列，这些阵列具有高空间分辨率，但cDNA的数量受到染色体上编码基因的限制，并且由于交叉杂交它们的灵敏度很低。[15]这导致无法在全基因组范围检测单拷贝变化。[21]最新的方法是用短寡核苷酸点样阵列。寡核苷酸的数量几乎是无限的，并且处理快速、经济有效和简单。尽管寡核苷酸不具有检测单拷贝变化的灵敏度，但是在染色体上彼此相邻的寡核苷酸的比率的平均值可以补偿降低的灵敏度。[22]也可以使用具有重叠探针的阵列，以便揭示特定的断点。 |
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'''设计方法''' |
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===设计方法=== |
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CGH应用的微阵列设计有两种：全基因组和靶向。 |
CGH应用的微阵列设计有两种：全基因组和靶向。 |
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全基因组阵列设计覆盖整个人类基因组，通常包括在整个基因组中 |
全基因组阵列设计覆盖整个人类基因组，通常包括在整个基因组中广泛覆盖的克隆，以及在基因组范围内具有连续覆盖的阵列。全基因组阵列主要用于研究，在发现基因方面有突出价值。它们以空前的分辨率筛选基因组的DNA获得和丢失，这也非常有价值。[18] |
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针对基因组的特定区域设计靶向阵列，以评估该靶向区段。它可以研究特定染色体或染色体片段，或鉴定和评估具有疑似微缺失综合征或亚端粒重排的个体的特定DNA剂量异常。靶向微阵列在医疗实践中的关键目标是为不平衡的细胞遗传学异常的诊断、遗传咨询、预后和临床管理提供临床上有用的结果。[18] |
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==应用== |
==应用== |
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[[File:ACGH profile of the IMR32 neuroblastoma cell line.svg|缩略图|IMR32神经母细胞瘤细胞系的aCGH谱]] |
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===传统=== |
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'''传统''' |
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传统CGH主要用于鉴定[[肿瘤]]中反复丢失或获得的染色体区域，以及[[癌症]]的诊断和预后<ref>Weiss MM, Kuipers EJ, Meuwissen SG, van Diest PJ, Meijer GA (2003) Comparative genomic hybridization as a supportive tool in diagnostic pathology. J Clin Pathol 56:522–527.</ref>。该方法还可用于研究[[胎儿]]和[[新生儿]]基因组中的[[染色体畸变]]。此外，传统CGH可用于检测染色体异常，并已被证明可有效诊断与人类遗传疾病相关的复杂异常<ref name="Oostlander,Meijer,Ylstra" />。 |
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传统CGH主要用于鉴定肿瘤中反复丢失或获得的染色体区域，以及癌症的诊断和预后。[23]该方法还可用于研究胎儿和新生儿基因组中的染色体畸变。此外，传统CGH可用于检测染色体异常，并已被证明可有效诊断与人类遗传疾病相关的复杂异常。[15] |
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===在癌症研究中=== |
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[[File:ACGH profile of the IMR32 neuroblastoma cell line.svg|right|thumb|IMR32神经母细胞瘤细胞系的aCGH谱（圖2）]] |
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来自同一类型肿瘤的几项研究的CGH数据显示出一致的非随机遗传畸变模式<ref name="Forozan,Karhu,Kononen,Kallioniemi,Kallioniemi">{{cite journal | vauthors = Forozan F, Karhu R, Kononen J, Kallioniemi A, Kallioniemi OP | year = 1997 | title = Genome screening by comparative genomic hybridization | url = | journal = Trends Genet | volume = 13 | issue = 10| pages = 405–409 | doi=10.1016/s0168-9525(97)01244-4}}</ref>。这些变化中的一些似乎对于各种恶性肿瘤是常见的，而其他变化则更具肿瘤特异性。例如，染色体区域lq、3q和8q的获得以及8p、13q、16q和17p的丢失对于许多类型的肿瘤是常见的，例如乳腺癌、[[卵巢癌]]、[[前列腺癌]]、[[肾癌]]和[[膀胱癌]]（图2）；其他改变，如[[睾丸癌]]的12p和Xp获得、膀胱癌的13q获得9q丢失、肾癌的14q丢失和卵巢癌的Xp丢失，它们更具特异性，可能反映了不同器官癌症发展过程中独特的选择<ref name="Forozan,Karhu,Kononen,Kallioniemi,Kallioniemi" />。阵列CGH也经常用于B细胞恶性肿瘤的研究和诊断，如慢性淋巴细胞白血病<ref>{{cite journal|pmid=23608880 | doi=10.1016/j.leukres.2013.03.018 | volume=37 | issue=7 | title=The origin of deletion 22q11 in chronic lymphocytic leukemia is related to the rearrangement of immunoglobulin lambda light chain locus | journal=Leuk Res | pages=802–8 | vauthors=Mraz M, Stano Kozubik K, Plevova K, Musilova K, Tichy B, Borsky M, Kuglik P, Doubek M, Brychtova Y, Mayer J, Pospisilova S| year=2013 }}</ref>。 |
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===染色体畸变=== |
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[[猫叫综合征]]（CdC）是由5号染色体短臂的部分缺失引起的综合征<ref name="Levy,Dunn,Kern,Hirschhorn,Kardon">{{cite journal | vauthors = Levy B, Dunn TM, Kern JH, Hirschhorn K, Kardon NB | year = 2002 | title = Delineation of the dup5q phenotype by molecular cytogenetic analysis in a patient with dup5q/del 5p (Cri du Chat) | url = | journal = Am J Med Genet | volume = 108 | issue = 3| pages = 192–197 | doi=10.1002/ajmg.10261}}</ref>。研究表明，传统CGH适用于检测缺失以及更复杂的染色体改变。例如，Levy等人在2002年报道了一个像猫一样哭泣的婴儿，这是CdC的标志，但核型模糊。CGH分析揭示染色体的5p15.3区段丢失，证实了临床诊断。这些结果表明，传统的CGH是检测结构畸变的可靠技术，在特定情况下，可以更有效地诊断复杂的异常<ref name="Levy,Dunn,Kern,Hirschhorn,Kardon" />。 |
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在癌症研究中 |
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===阵列CGH=== |
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阵列CGH主要检测癌症中的基因组异常，但也适用于分析导致人类遗传疾病的DNA拷贝数异常<ref name="Oostlander,Meijer,Ylstra" />，即揭示缺失、扩增、断裂和倍性异常。 早期诊断对患者有益，因为他们可能会接受适当的治疗和咨询以改善他们的预后<ref name="Marquis-Nicholson,Aftimos,Hayes,George,Love" />。 |
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来自同一类型肿瘤的几项研究的CGH数据显示出一致的非随机遗传畸变模式。[24]这些变化中的一些似乎对于各种恶性肿瘤是常见的，而其他变化则更具肿瘤特异性。例如，染色体区域lq、3q和8q的获得，以及8p、13q、16q和17p的丢失，对于许多类型的肿瘤是常见的，比如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌和膀胱癌（图3.）。其他改变，如睾丸癌的12p和Xp获得，膀胱癌的13q获得和9q丢失，肾癌的14q丢失以及卵巢癌的Xp丢失，它们更具特异性，这可能反映了不同器官癌症发展过程中独特的选择。[24]阵列CGH也经常用于B细胞恶性肿瘤的研究和诊断，如慢性淋巴细胞白血病。[25] |
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====癌症的基因组异常==== |
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遗传改变和重排在癌症中经常发生并且促进其发病。通过阵列CGH检测这些畸变，提供了关于重要癌症基因位点的信息，在诊断、癌症分类和预后中具有临床价值<ref name="Bejjani,Shaffer" />，但并非所有遗传物质的丢失都是致病的，因为一些DNA在[[免疫球蛋白]]亚基的重排过程中会有生理性的丢失<ref>{{Cite journal | last1 = Mraz | first1 = M. | last2 = Stano Kozubik | first2 = K. | last3 = Plevova | first3 = K. | last4 = Musilova | first4 = K. | last5 = Tichy | first5 = B. | last6 = Borsky | first6 = M. | last7 = Kuglik | first7 = P. | last8 = Doubek | first8 = M. | last9 = Brychtova | first9 = Y. | last10 = Mayer | doi = 10.1016/j.leukres.2013.03.018 | first10 = J. | last11 = Pospisilova | first11 = S. | title = The origin of deletion 22q11 in chronic lymphocytic leukemia is related to the rearrangement of immunoglobulin lambda light chain locus | journal = Leukemia Research | volume = 37 | issue = 7 | pages = 802–808 | year = 2013 | pmid = 23608880 | pmc = }}</ref>。在最近的一项研究中，使用阵列CGH识别几种乳腺癌小鼠模型中的染色体畸变区域（拷贝数变异），从而在myc诱导的肿瘤发生过程中鉴定出合作基因<ref name="aprelikova">{{cite journal | vauthors = Aprelikova O, Chen K, El Touny LH, Brignatz-Guittard C, Han J, Qiu T, Yang HH, Lee MP, Zhu M, Green JE | title = The epigenetic modifier JMJD6 is amplified in mammary tumors and cooperates with c-Myc to enhance cellular transformation, tumor progression, and metastasis | journal = Clin Epigenetics | volume = 8 | issue = 38 | date = Apr 2016 | doi = 10.1186/s13148-016-0205-6 | url = http://clinicalepigeneticsjournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13148-016-0205-6}}</ref>。 |
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染色体畸变 |
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阵列CGH不仅可以发现癌症的染色体异常，还可以监测肿瘤的发展。一旦通过阵列CGH识别出异常，可以使用FISH区分转移性和轻度病变<ref name="deRavel,Devriendt,Fryns,Vermeesch" /><ref name="Marquis-Nicholson,Aftimos,Hayes,George,Love" />。 |
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猫叫综合征（CdC）是由5号染色体短臂的部分缺失引起的综合征。[26]一些研究表明，传统CGH适用于检测缺失以及更复杂的染色体改变。例如，Levy等人在2002年报道了一个像猫一样哭泣（这是CdC的特点）的婴儿，但其核型模糊。CGH分析揭示染色体的5p15.3区段丢失，证实了临床诊断。这些结果表明，传统CGH是检测结构畸变的可靠技术，在特定情况下可以更有效地诊断复杂的异常。[26] |
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====亚微观畸变==== |
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Prader-Willi综合征（PWS）是一种涉及15q11-13的父系结构异常，而同一区域的母系畸变导致Angelman综合征（AS）。在这两种综合征中，大多数病例（75%）是PWS/AS关键区域3-5Mb缺失的结果<ref>L'Hermine AC, Aboura A, Brisset S, Cuisset L, Castaigne V, Labrune P, Frydman R, Tachdjian G. (2003) Fetal phenotype of Prader–Willi syndrome due to maternal disomy for chromosome 15. Prenat Diagn 23:938–943.</ref>。使用细胞遗传学或传统CGH无法检测到这些小的异常，但阵列CGH可以轻松检测到。为了证明其原理，Vissers等人在2003年制造了具有1Mb分辨率的基因组宽阵列，以筛选具有已知微缺失综合征（经FISH验证）的三名患者，其中一名患有PWS。在所有患者中，很容易就发现1.5至2.9Mb的异常<ref>{{cite journal | vauthors = Vissers LE, de Vries BB, Osoegawa K, Janssen IM, Feuth T, Choy CO, Straatman H, van der Vliet W, Huys EH, van Rijk A, Smeets D, van Ravenswaaij-Arts CM, Knoers NV, van der Burgt I, de Jong PJ, Brunner HG, Geurts , van Kessel A, Schoenmakers EF, Veltman JA | year = 2003 | title = Array-based comparative genomic hybridization for the genome-wide detection of submicroscopic chromosomal abnormalities | url = | journal = Am J Hum Genet | volume = 73 | issue = | pages = 1261–1270 }}</ref>。因此证明阵列CGH是检测亚微观畸变的特效且敏感的方法。当使用重叠微阵列时，还可以揭示染色体畸变中涉及的断点。 |
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'''阵列CGH''' |
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====产前基因诊断==== |
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虽然阵列CGH作为胚胎植入前遗传筛查尚未被广泛应用，但是它的概念正越来越流行。它可以检测[[卵子]]、[[精子]]或[[胚胎]]中的CNV和非整倍性，这些可能导致胚胎植入失败、[[流产]]或[[唐氏综合症]]（21三体综合征）。这使得阵列CGH成为一种有前途的工具，可以降低因生活改变的发病率并提高体外受精的成功率。该技术涉及单细胞的全基因组扩增，然后用于阵列CGH。它也可以用于携带染色体易位的夫妇，例如平衡的[[互易易位]]或[[罗伯逊易位]]，它们有可能在其后代中引起染色体失衡<ref name="Evangelidou,Alexandrou,Moutafi,Ioannides,Antonios,Koumbaris,Kallikas,Velissariou,Sismani,Patsalis" /><ref>{{cite journal | vauthors = Fiorentino F | year = 2012 | title = Array comparative genomic hybridization: its role in preimplantation genetic diagnosis | url = | journal = Current Opinion in Obstetrics and Gynecology | volume = 24 | issue = | pages = 203–209 | doi=10.1097/gco.0b013e328355854d}}</ref><ref>{{cite journal | vauthors = Lee CN, Lin SY, Lin CH, Shih JC, Lin TH, Su YN | year = 2012 | title = Clinical utility of array comparative genomic hybridization for prenatal diagnosis: a cohort study of 3171 pregnancies | url = | journal = BJOG: An International Journal of Obstetrics & Gynaecology | volume = 119 | issue = | pages = 614–625 | doi=10.1111/j.1471-0528.2012.03279.x}}</ref>。 |
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阵列CGH主要用于检测癌症中的基因组异常，不过它也适用于分析导致人类遗传疾病的DNA拷贝数异常。[15]亦即阵列CGH用于揭示缺失、扩增、断点和倍性异常。早期诊断对患者有益，因为他们可能会接受合适的治疗和咨询以改善他们的预后。[11] |
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==CGH和阵列CGH的局限性== |
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传统CGH的主要缺点是不能检测没有拷贝数变化的结构染色体畸变，例如镶嵌体、平衡染色体易位和倒位。CGH也只能检测倍性水平的获得和丢失<ref>Weiss MM, Hermsen MAJA, Meijer GA, van Grieken NCT, Baak JPA, Kuipers EJ, van Deist PJ (1999) Comparative genomic hybridization. J Clin Pathol: Mol Pathol 52:243–251.</ref>。此外，具有短重复序列的染色体区域在个体之间变化很大，并且可能干扰CGH分析<ref name="Oostlander,Meijer,Ylstra" />。因此，像[[着丝粒]]和[[端粒]]这样的重复DNA区域需要用未标记的重复DNA（例如Cot1-DNA）阻断或从筛选中省略<ref>du Manoir S, Schrock E, Bentz M, Speicher MR, Joos S, Ried T, Lichter P, Cremer T (1995) Quantitative analysis of comparative genomic hybridization. Cytometry 19:27–41.</ref>。此外，传统CGH的分辨率是限制其临床应用的主要问题。尽管CGH已被证明是癌症和人类遗传疾病研究和诊断中有用且可靠的技术，但这些应用仅涉及严重异常。由于中期染色体的分辨率有限，使用传统CGH无法检测到小于5-10 Mb的畸变<ref name="Forozan,Karhu,Kononen,Kallioniemi,Kallioniemi" />。为了检测这种异常，需要高分辨率技术。阵列CGH突破了许多限制，它的特点在于高分辨率，这是相比传统CGH的主要优点。它的标准分辨率在1-5Mb之间，通过用额外的克隆补充阵列可以将其增加到大约40kb。然而，与传统的CGH一样，阵列CGH的主要缺点是无法检测到不引起拷贝数变化的畸变，并且其检测镶嵌现象的能力有限<ref name="Oostlander,Meijer,Ylstra" />。能检测到的镶嵌性水平取决于克隆的灵敏度和空间分辨率。目前的检测极限是大约50%的细胞中的重排。为了检测这种异常，还必须使用其他技术，如SKY（光谱核型分析）或FISH<ref>{{cite journal | vauthors = Shaw CJ, Stankiewicz P, Bien-Willner G, Bello SC, Shaw CA, Carrera M, Perez Jurado L, Estivill X, Lupski JR | year = 2004 | title = Small marker chromosomes in two patients with segmental aneusomy for proximal 17p | url = | journal = Hum Genet | volume = 115 | issue = 1| pages = 1–7 | pmid = 15098121 | doi = 10.1007/s00439-004-1119-5 }}</ref>。 |
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癌症的基因组异常 |
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遗传改变和重排在癌症中经常发生并且促进其发生。通过阵列CGH检测这些畸变，提供了关于重要癌症基因位点的信息，在诊断、癌症分类和预后中具有临床价值。[18]然而并非所有遗传物质的丢失都是致病的，因为一些DNA在免疫球蛋白亚基的重排过程中会有生理性的丢失。[27]在最近的一项研究中，使用阵列CGH识别数个乳腺癌小鼠模型中的染色体畸变（拷贝数变异）区域，从而在myc诱导的肿瘤发生过程中鉴定出合作基因。[28] |
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阵列CGH不仅可以发现癌症的染色体异常，还可以监测肿瘤的发展。一旦通过阵列CGH识别出异常，可以采用FISH区分转移性和轻度病变。<sup>[6][11]</sup> |
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arrayMap网站[29]提供对预处理的拷贝数简档的访问，和来自数万个基因组阵列的临床注释，以及在线可视化工具和程序化数据访问。 |
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亚微观畸变 |
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Prader-Willi综合征（PWS）是一种涉及15q11-13的父系结构异常，而同一区域的母系畸变导致Angelman综合征（AS）。在这两种综合征中，大多数病例（75%）是PWS/AS关键区域3-5Mb缺失的结果。[30]细胞遗传学或传统CGH无法检测到这些小的畸变，但阵列CGH可以轻松检测到。为了证明其原理，Vissers等人在2003年制造了具有1Mb分辨率的全基因组范围阵列，以筛查三名具有已知微缺失综合征（经FISH验证）的患者，其中一名患有PWS。在三名患者中容易发现1.5-2.9Mb的异常。[31]由此证明阵列CGH是检测亚微观畸变的特效且敏感的方法。 |
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当使用重叠微阵列时，还可以揭示染色体畸变中的断点。 |
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产前基因诊断 |
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虽然阵列CGH尚未被广泛用作胚胎植入前的遗传筛查，但是它的概念正越来越普及。它可以检测卵子、精子或胚胎中的CNV和非整倍性，这些可能导致胚胎植入失败、流产或唐氏综合症（21三体综合征）等疾病。这使得阵列CGH成为一种有前途的工具，可以降低终身恶性疾病的发病率和提高体外受精的成功率。该技术涉及单细胞的全基因组扩增（用于阵列CGH）。它也可以用于携带染色体易位的夫妇，例如平衡的互易易位或Robertsonian易位，它们有可能在其后代中引起染色体失衡。<sup>[13][32][33]</sup> |
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==CGH和阵列CGH的局限性== |
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传统CGH的主要缺点是不能检测没有拷贝数变化的结构染色体畸变，例如镶嵌体、平衡染色体易位和倒位。CGH也只能检测倍性水平的获得和丢失。[34]另外，具有短重复序列的染色体区域在个体之间变化很大，并且可能干扰CGH分析。[15]因此，像着丝粒和端粒这样的重复DNA区域需要用未标记的重复DNA（例如Cot1-DNA）阻断或从筛选中省略。[35]此外，传统CGH的分辨率是限制其临床应用的主要问题。尽管CGH已被证明是癌症和人类遗传疾病研究和诊断中有用且可靠的技术，但这些应用仅涉及严重异常。由于中期染色体的分辨率有限，使用传统CGH无法检测到小于5-10 Mb的畸变。[24]检测这种异常需要高分辨率技术。阵列CGH突破了许多限制，它的特点在于高分辨率，这是相比传统CGH的主要优点。它的标准分辨率在1-5Mb之间，通过补充额外的克隆可以将其提高到40kb左右。然而与传统的CGH一样，阵列CGH的主要缺点是无法检测到不引起拷贝数变化的畸变，并且其检测镶嵌现象的能力有限。[15]能检测到的镶嵌现象程度取决于克隆的灵敏度和空间分辨率。目前的检测极限是大约50%的细胞中的重排。为了检测这种异常，还必须采用其他技术，如SKY（光谱核型分析）或FISH。[36] |
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==参见== |
==参见== |
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*[[细胞遗传学]] |
*[[细胞遗传学]] 虚拟核型 |
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==参考文 |
==参考文献== |
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於 2018年8月18日 (六) 16:19 的修訂
比較基因組雜交（Comparative genomic hybridization）是一種分子細胞遺傳學方法，在不培養細胞的情況下，分析相對於參照樣品，測試樣品的DNA中拷貝數變異（CNV）的多倍性程度。其目的是快速有效地比較兩個來源的兩組DNA樣本，這兩組DNA通常是密切相關的，因為兩者在整個染色體或亞染色體區域（整個染色體的一部分）上都可能有獲得或丟失。該技術最初是為了評估實體瘤和正常組織的染色體互補差異而開發的，[1]相比更傳統的Giemsa顯帶技術和熒光原位雜交技術（FISH）（受限於所使用的顯微鏡解像度），它的解像度提高到了5-10Mb。[2][3]
這項技術是通過競爭性熒光原位雜交實現的。簡言之，從待比較的兩個樣品（通常是測試和參照樣品）中分離DNA，用不同顏色（通常是紅色和綠色）的熒光團（熒光分子）分別標記兩組DNA樣品，變性DNA使其成為單鏈，再將兩組的1：1混合物與正常中期染色體進行雜交，並且結合在原位。然後使用熒光顯微鏡和計算機軟件，縱向比較雜交染色體熒光信號的着色差異，以鑑別兩組的染色體差異。雜交染色體特定區域中的測試樣品顏色較強，表示測試樣品中該區域有獲得，而參照樣品顏色較強表示測試樣品中有丟失。中性色（黃色，當同時標記紅色和綠色）則表示兩個樣品在該區域沒有差異。[2][3]
CGH只能檢測不平衡的染色體異常，這是因為平衡的染色體異常（例如易位、倒位或環狀染色體）不影響拷貝數。不過CGH確實能夠在單次測試中探測全部46條人類染色體，並且可以發現缺失和重複，甚至在微觀尺度上，可以再用其他細胞學技術進一步鑑定候選基因。[2][4]
通過結合CGH技術和DNA微陣列，已經開發出更特效的陣列CGH（aCGH），它可以逐點檢測CNV，解像度精確到100kb。[5][6]這種改進的技術可以發現已知和未知的致病位點。
歷史
發展CGH的動機：顯微鏡限制了當時可用的細胞遺傳學分析技術（Giemsa顯帶和FISH）的解像度。此外Giemsa顯帶解釋模糊，準確性偏低，而且這兩種技術都需要投入大量人力，這就對可檢查位點造成了限制。[5]
CGH分析的第一份報告出自Kallioniemi及其同事（1992年，加利福尼亞大學三藩市分校），內容關於實體腫瘤。他們將該技術直接應用於乳腺癌細胞系和原發性膀胱腫瘤，建立完整的細胞拷貝數核型，識別出了16個不同的擴增區域，其中許多是新發現的。[1]
不久之後，在1993年，du Manoir等人用幾乎相同的方法，在DNA文庫用不同比例的兩種熒光團繪製了一系列單獨的人類染色體，以此來測試該技術，並將CGH應用於唐氏綜合症、T幼淋巴細胞性白血病和腎乳頭狀癌患者的基因組DNA。結果所得的熒光比率是準確的，並且可檢測到來自不同細胞類型的基因組DNA之間的差異，因此CGH是非常有效的細胞遺傳學分析工具。[7]
最初難以推廣CGH技術，因為實驗設計不統一而彼此不一致，特別是數據的解釋不確定。[3]然而1994年發表的一篇綜述詳細描述了一個易於理解的實驗設計，[8]並且圖像分析軟件可以商業化，這使得CGH在世界各地得到應用。[3]隨着顯微切割和簡併寡核苷酸引子聚合酶連鎖反應（DOP-PCR）等新技術用於生成DNA產物，而有可能將CGH應用於更小的染色體異常，從而提高CGH的解像度。[3]
1997年，Solinas-Tolodo等人開創了陣列CGH，使用DNA微陣列代替傳統的中期染色體製劑，來分析腫瘤細胞。[9]1998年，Pinkel等人則用其來分析乳腺癌細胞。[10]以上都是藉助人類基因組計劃實現的，該計劃創造了一個DNA克隆片段文庫，包括整個人類基因組的已知位點，而這些片段被用作DNA微陣列上的探針。[11]現在各種來源的探針，如cDNA、基因組PCR產物和細菌人工染色體（BACs）可用於DNA微陣列，總計可達200萬個探針。[11]陣列CGH是自動化的，因為探針遠小於中期染色體，所以比傳統CGH有更高的解像度（精確至100kb），需要的DNA數量較小，還可以根據需要定位到特定的染色體區域，甚至可以定製，因此分析速度更快，更適用於診斷。[11][12]
基本方法
中期載玻片製備
從核型正常的男性或女性獲得參照樣品DNA，置於載玻片上，優先使用女性DNA，因為它們具有兩條X染色體，其含有比男性Y染色體更多的遺傳資訊。使用植物血凝素刺激外周血中的淋巴細胞。將1ml肝素化血液加入10ml培養基中，並在37℃、5%CO2環境下培養72小時。加入秋水仙鹼中止細胞的有絲分裂，然後分離出細胞並用低滲氯化鉀處理，固定在3：1的甲醇/乙酸中。[3]
然後將一滴細胞懸浮液從約30cm的高度滴到用乙醇清潔過的載玻片上，最佳條件為室溫、濕度60-70%。使用相差顯微鏡可視化地評估載玻片，應觀察到最小的細胞質，染色體不能重疊，應該為400-550個條帶，並且沒有分離的染色單體，最後應顯示為深色而不具有光澤。之後將載玻片在室溫空氣下過夜乾燥，再以四個為一組儲存在-20℃下，並用二氧化矽珠或氮以保持乾燥。應測試不同的供體，因為雜交是可變的。可以使用市售的載玻片，但始終應先進行測試。[3]
從測試組織和參照組織中分離DNA
用標準苯酚萃取物從測試或參照（核型正常個體）組織提取DNA，其需要三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）和苯酚與等量的DNA水溶液的混合。然後通過攪拌和離心來分離混合液，之後除去水層並用乙醚進一步處理，最後用乙醇沉澱濃縮DNA。[3]
也可以使用基於親和層析柱的商品DNA分離試劑盒來完成。[3]
最優的是從新鮮或冷凍組織中提取DNA，因為這樣的質量最高，不過只要遵照適當的程式，現在也可以使用福爾馬林固定或石蠟包埋的庫存樣品。對於CGH實驗，0.5-1μg的DNA就足夠了，如果量不夠，可以使用DOP-PCR來擴增DNA，但是在這種情況下，需要同時擴增測試和參照樣品以提高準確性。[3]
DNA標記
用缺口轉譯標記DNA，切割DNA，並用熒光團（直接標記）、生物素或氧化苦苷標記的核苷酸替代後加入的綴合熒光團的抗體（間接標記）。隨後重要的一步是通過凝膠電泳檢查測試和參照DNA片段的長度，500kb-1500kb是最佳雜交範圍。[3]
阻斷
添加未標記的Life Technologies Corporation的Cot-1DNA®（富含長度為50bp-100bp的重複序列的胎盤DNA）以阻斷正常的DNA序列重複，特別是在着絲粒和端粒，因為如果檢測到這些序列，可能會降低熒光比率和漏測獲得或丟失。[3]
雜交
將8-12μl標記測試DNA和等量的標記參照DNA混合，加入40μg Cot-1DNA®，然後沉澱，隨後溶於6μl雜交混合液中，其含有50%甲酰胺（降低DNA解鏈溫度）和10%硫酸葡聚糖（增加pH7.0的標準枸櫞酸鹽水（SSC）溶液中的有效探針濃度）。[3]
分別進行載玻片和探針的變性。將載玻片在72℃的70%甲酰胺/2×SSC中浸沒5-10分鐘，同時80℃水浴探針10分鐘，並立即加入中期載玻片製備中。然後用蓋玻片覆蓋該反應，放置在40℃的潮濕房中2至4天。[3]
然後除去蓋玻片並給予多次5分鐘的洗滌，3次使用室溫的2xSSC，1次使用45℃的0.1xSSC，1次使用室溫的TNT。隨後預反應10分鐘，再進行60分鐘、37℃溫育，用TNT洗滌3次，每次5分鐘，之後用室溫的2×SSC洗滌1次。最後依次使用70%、96%、100%的乙醇乾燥載玻片，再用DAPI（0.35μg/ml）復染，用於染色體鑑定，並用蓋玻片密封。[3]
熒光可視化和成像
可視化需要：裝備針對DAPI染色的合適濾光鏡的熒光顯微鏡，以及使用兩種熒光團，並且這些濾光鏡（例如窄帶濾光鏡）還應最小化熒光團之間的串擾。顯微鏡必須提供均勻照度而且沒有色度變化，可以適當校準並具有復消色差的平面物鏡，放大倍數為x63或x100。[3]
使用至少0.1μm空間解像度的相機記錄圖像，像素至少600x600。相機還必須能夠融合至少5到10秒的圖像，其最小光度解像度為8bit。[3]
可用市售的專門CGH軟件處理圖像，需要減去背景噪聲，去除和分割非染色體來源的內容，使熒光比率標準化，進行交互式核型分析和縮放染色體至標準長度。通過平均多個高質量中期染色體的比率生成了—呈現缺失或擴增的染色體區域的「相對拷貝數核型」，並沿着染色體模式圖（基於顯帶模式識別染色體）繪製它們。使用固定或統計閾值（置信區間）對比率概況進行解釋，當95%的熒光比率不包含1.0時，認為有獲得或丟失。[3]
額外說明
必須特別注意避免DNA的污染，特別是測試DNA，因為污染了正常DNA會使結果偏向而接近1.0，由此可能會檢測不到異常。可以使用FISH、PCR和流式細胞計量術來驗證結果。[5][13]
陣列比較基因組雜交
陣列比較基因組雜交（基於微陣列的比較基因組雜交，矩陣CGH，陣列CGH，aCGH）是一種分子細胞遺傳學技術，能在基因組範圍內高解像度地檢測染色體的拷貝數變化。[14] 陣列CGH將患者的基因組與參照基因組進行比較，鑑定兩個基因組之間的差異，並利用與傳統CGH相同的競爭性熒光原位雜交原理來定位患者基因組失衡的區域。
陣列CGH克服了傳統CGH的主要缺點—低解像度。在陣列CGH中，中期染色體被DNA克隆片段（+100-200kb）取代，其中確切的染色體位點是已知的。這樣可以更詳細地檢測畸變，而且可以將變化直接映射到基因組序列上。[15]
陣列CGH已被證明是一種特異、靈敏、快速和高通量的技術，與其他分析DNA拷貝數變化的方法相比具有相當大的優勢，更適合應用於診斷。使用這種方法，可以檢測到5-10kb水平的拷貝數變化。[16]截至2006年，高解像度CGH（HR-CGH）陣列能以200 bp的解像度準確檢測結構變異（SV）。[17]該方法能夠識別新的復發性染色體變化，例如由於染色體畸變導致的癌症和先天性缺陷的微缺失和重複。
方法
陣列CGH基於與傳統CGH相同的原理。在這兩種技術中，用兩種不同的熒光團對來自參照（或對照）樣品的DNA和來自測試（或患者）樣品的DNA進行差異標記，並用作與靶標核酸競爭性共雜交的探針。在傳統CGH中，靶標是參照的中期染色體。在陣列CGH中，這些靶標可以是克隆在多種載體（如BACs或質粒）、cDNA或寡核苷酸中的基因組片段。[18]
圖2.[15]是陣列CGH技術的概略示意圖。用紅色熒光團（Cyanine 5）標記來自待測樣品的DNA，用綠色熒光團（Cyanine 3）標記參照樣品DNA。將等量的兩種DNA樣品混合併共雜交至含有數千個均勻間隔的DNA克隆片段或寡核苷酸的DNA微陣列（一式三份點樣到陣列上）。雜交後，用數字成像系統捕獲和量化每種雜交熒光團的相對熒光強度。[18]得到的熒光強度比與測試和參照基因組中DNA序列的拷貝數比成比例。如果熒光染色體的強度在一個探針上相等，則認為患者基因組的該區域在測試和參照樣品中具有等量的DNA；如果Cy3：Cy5比例發生改變，則表明該區域有丟失或獲得。[19]
陣列CGH的技術方法
陣列CGH是通過各種技術實現的，因此它的優缺點取決於所選擇的技術。最初的方法是插入大片段的克隆DNA（例如BACs）產生陣列。BACs的使用提供了足夠強烈的信號來檢測單拷貝變化並準確定位畸變邊界。然而分離的BACs克隆的初期DNA產量低，必需DNA擴增技術。這些技術包括連接介導的聚合酶連鎖反應（PCR），使用一組或幾組引子的簡併引子PCR，以及滾環擴增。[20]也可以使用cDNA構建陣列，這些陣列具有高空間解像度，但cDNA的數量受到染色體上編碼基因的限制，並且由於交叉雜交它們的靈敏度很低。[15]這導致無法在全基因組範圍檢測單拷貝變化。[21]最新的方法是用短寡核苷酸點樣陣列。寡核苷酸的數量幾乎是無限的，並且處理快速、經濟有效和簡單。儘管寡核苷酸不具有檢測單拷貝變化的靈敏度，但是在染色體上彼此相鄰的寡核苷酸的比率的平均值可以補償降低的靈敏度。[22]也可以使用具有重疊探針的陣列，以便揭示特定的斷點。
設計方法
CGH應用的微陣列設計有兩種：全基因組和靶向。
全基因組陣列設計覆蓋整個人類基因組，通常包括在整個基因組中廣泛覆蓋的克隆，以及在基因組範圍內具有連續覆蓋的陣列。全基因組陣列主要用於研究，在發現基因方面有突出價值。它們以空前的解像度篩選基因組的DNA獲得和丟失，這也非常有價值。[18]
針對基因組的特定區域設計靶向陣列，以評估該靶向區段。它可以研究特定染色體或染色體片段，或鑑定和評估具有疑似微缺失綜合症或亞端粒重排的個體的特定DNA劑量異常。靶向微陣列在醫療實踐中的關鍵目標是為不平衡的細胞遺傳學異常的診斷、遺傳諮詢、預後和臨床管理提供臨床上有用的結果。[18]
應用
傳統
傳統CGH主要用於鑑定腫瘤中反覆丟失或獲得的染色體區域，以及癌症的診斷和預後。[23]該方法還可用於研究胎兒和新生兒基因組中的染色體畸變。此外，傳統CGH可用於檢測染色體異常，並已被證明可有效診斷與人類遺傳疾病相關的複雜異常。[15]
在癌症研究中
來自同一類型腫瘤的幾項研究的CGH數據顯示出一致的非隨機遺傳畸變模式。[24]這些變化中的一些似乎對於各種惡性腫瘤是常見的，而其他變化則更具腫瘤特異性。例如，染色體區域lq、3q和8q的獲得，以及8p、13q、16q和17p的丟失，對於許多類型的腫瘤是常見的，比如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌和膀胱癌（圖3.）。其他改變，如睾丸癌的12p和Xp獲得，膀胱癌的13q獲得和9q丟失，腎癌的14q丟失以及卵巢癌的Xp丟失，它們更具特異性，這可能反映了不同器官癌症發展過程中獨特的選擇。[24]陣列CGH也經常用於B細胞惡性腫瘤的研究和診斷，如慢性淋巴細胞白血病。[25]
染色體畸變
貓叫綜合症（CdC）是由5號染色體短臂的部分缺失引起的綜合症。[26]一些研究表明，傳統CGH適用於檢測缺失以及更複雜的染色體改變。例如，Levy等人在2002年報道了一個像貓一樣哭泣（這是CdC的特點）的嬰兒，但其核型模糊。CGH分析揭示染色體的5p15.3區段丟失，證實了臨床診斷。這些結果表明，傳統CGH是檢測結構畸變的可靠技術，在特定情況下可以更有效地診斷複雜的異常。[26]
陣列CGH
陣列CGH主要用於檢測癌症中的基因組異常，不過它也適用於分析導致人類遺傳疾病的DNA拷貝數異常。[15]亦即陣列CGH用於揭示缺失、擴增、斷點和倍性異常。早期診斷對患者有益，因為他們可能會接受合適的治療和諮詢以改善他們的預後。[11]
癌症的基因組異常
遺傳改變和重排在癌症中經常發生並且促進其發生。通過陣列CGH檢測這些畸變，提供了關於重要癌症基因位點的資訊，在診斷、癌症分類和預後中具有臨床價值。[18]然而並非所有遺傳物質的丟失都是致病的，因為一些DNA在免疫球蛋白亞基的重排過程中會有生理性的丟失。[27]在最近的一項研究中，使用陣列CGH識別數個乳腺癌小鼠模型中的染色體畸變（拷貝數變異）區域，從而在myc誘導的腫瘤發生過程中鑑定出合作基因。[28]
陣列CGH不僅可以發現癌症的染色體異常，還可以監測腫瘤的發展。一旦通過陣列CGH識別出異常，可以採用FISH區分轉移性和輕度病變。[6][11]
arrayMap網站[29]提供對預處理的拷貝數簡檔的訪問，和來自數萬個基因組陣列的臨床註釋，以及在線可視化工具和程式化數據訪問。
亞微觀畸變
Prader-Willi綜合症（PWS）是一種涉及15q11-13的父繫結構異常，而同一區域的母系畸變導致Angelman綜合症（AS）。在這兩種綜合症中，大多數病例（75%）是PWS/AS關鍵區域3-5Mb缺失的結果。[30]細胞遺傳學或傳統CGH無法檢測到這些小的畸變，但陣列CGH可以輕鬆檢測到。為了證明其原理，Vissers等人在2003年製造了具有1Mb解像度的全基因組範圍陣列，以篩查三名具有已知微缺失綜合症（經FISH驗證）的患者，其中一名患有PWS。在三名患者中容易發現1.5-2.9Mb的異常。[31]由此證明陣列CGH是檢測亞微觀畸變的特效且敏感的方法。
當使用重疊微陣列時，還可以揭示染色體畸變中的斷點。
產前基因診斷
雖然陣列CGH尚未被廣泛用作胚胎植入前的遺傳篩查，但是它的概念正越來越普及。它可以檢測卵子、精子或胚胎中的CNV和非整倍性，這些可能導致胚胎植入失敗、流產或唐氏綜合症（21三體綜合症）等疾病。這使得陣列CGH成為一種有前途的工具，可以降低終身惡性疾病的發病率和提高體外受精的成功率。該技術涉及單細胞的全基因組擴增（用於陣列CGH）。它也可以用於攜帶染色體易位的夫婦，例如平衡的互易易位或Robertsonian易位，它們有可能在其後代中引起染色體失衡。[13][32][33]
CGH和陣列CGH的局限性
傳統CGH的主要缺點是不能檢測沒有拷貝數變化的結構染色體畸變，例如鑲嵌體、平衡染色體易位和倒位。CGH也只能檢測倍性水平的獲得和丟失。[34]另外，具有短重複序列的染色體區域在個體之間變化很大，並且可能干擾CGH分析。[15]因此，像着絲粒和端粒這樣的重複DNA區域需要用未標記的重複DNA（例如Cot1-DNA）阻斷或從篩選中省略。[35]此外，傳統CGH的解像度是限制其臨床應用的主要問題。儘管CGH已被證明是癌症和人類遺傳疾病研究和診斷中有用且可靠的技術，但這些應用僅涉及嚴重異常。由於中期染色體的解像度有限，使用傳統CGH無法檢測到小於5-10 Mb的畸變。[24]檢測這種異常需要高解像度技術。陣列CGH突破了許多限制，它的特點在於高解像度，這是相比傳統CGH的主要優點。它的標準解像度在1-5Mb之間，通過補充額外的克隆可以將其提高到40kb左右。然而與傳統的CGH一樣，陣列CGH的主要缺點是無法檢測到不引起拷貝數變化的畸變，並且其檢測鑲嵌現象的能力有限。[15]能檢測到的鑲嵌現象程度取決於克隆的靈敏度和空間解像度。目前的檢測極限是大約50%的細胞中的重排。為了檢測這種異常，還必須採用其他技術，如SKY（光譜核型分析）或FISH。[36]
參見
- 細胞遺傳學 虛擬核型
參考文獻
外部連結
- Virtual Grand Rounds: "Differentiating Microarray Technologies and Related Clinical Implications" by Arthur Beaudet, MD
- Progenetix database: A large, continuously updated collection of CGH and aCGH and associated clinical data (ca. 32'000 cases, September 2014).
- CGH article tracker: An attempt to list all (a)CGH publications containing original case data (2538 as of September 2014). This is part of the Progenetix project.
- arrayMap repository: Continuously expanded collection cancer genome array datasets, with per-array and aggregated data visualisation (ca. 64'000 arrays, September 2014).
- NCBI's Cancer Chromosomes: Cancer Chromosome is an integral part of NCBI's Entrez system, which combines several databases with (molecular-) cytogenetic data.
- CGH Microarray