即时聚合酶链式反应

关于RT-PCR, reverse transcription-PCR 请参考 逆转录PCR 条目

即时定量PCR（quantitative real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次PCR循环后产物总量的方法（Higuchi et al., 1992）。即时定量PCR（real-time qPCR）及定量反转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）已被众多科学家采用，因为其侦测范围广、灵敏度高、准确、专一及快速。qPCR的发展因为侦测感染病患的病毒或细菌量、癌症监测、诊断个别基因差异的用药反应等应用而大幅提高。

qPCR的方法是基于侦测目标物在反应前及PCR后产物的量化关系。相对于终端PCR方式（end-point PCR，传统的PCR配合凝胶电泳，在反应后侦测）qPCR有许多优点。其结果可以较快取得且稳定，因为是采用非常敏感的化学萤光，而且不需要在PCR反应后的侦测步骤。此外，因为反应后不需打开管子而减少了操作污染。qPCR分析亦适于更具挑战性的应用，如多重侦测与高通量分析。

原理

使用于qPCR侦测的化学物基本可分为两类：非专一性化学物通常是与DNA结合的萤光染剂；目标专一性化学物是使用萤光探针或引子。 即时PCR的萤光化学

非专一性侦测

SybrGreen、HRM(High Resolution Melt)

目标专一性侦测

TaqMan probe、Molecular Beacon、LightUp、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)

温度反应步骤

多重分析的温度最佳化

仪器

光源

氙气灯、激光、发光二极管（LED）

滤镜

侦测方式

光电倍增管（photomultiplier tube, PMT）、光电耦合元件（charge-coupled device, CCD）、光电二极管（photodiodes）

控温方式

热电效应元件（peltier elements）、旋转式气流升降温、微流体式

容器

聚丙烯（PP）容器、玻璃毛细管

数据分析

门槛循环（Threshold cycle, Ct或称阈值）

解离曲线分析（melting curve）

高分辨率解离分析（High Resolution Melt, HRM）

FRET分析

应用

基因表现分析、检验生物芯片的结果、siRNA与miRNA、诊断、基因型鉴定

优点

荧光实时定量PCR的基本原理有两个要点：首先是对PCR反应中的每一个循环的反应产物进行实时检测并记录下来；其次，用于检测PCR产物实时检测的荧光染料标记在一段可以与单链PCR产物(模板)特异性杂交的探针上，并且处于淬灭状态，只有当探针与模板特异性结合以后才有可能释放出荧光信号，要实现这一点可以有以下两种方法：一是选取PCR上下游引物之间的一段序列作为探针，并在探针的5`-端标记上荧光基团，3`-端标记上相应的淬灭基团(由于两个基团靠得很近，构成荧光能量传递的关系，没有荧光信号产生，在每一个循环的退火过程中，该探针可以与模板相结合，随后的延伸反应中，当引物合成至探针与模板结合处时，Taq酶的5`-外切酶活性可以降解探针的5`-端，并因此是荧光基团与淬灭基团分离，释放荧光，理论上每合成一次新链就有一次荧光信号释放)；二是探针片段在游离状态下呈茎襻(stem-loop)结构，其中茎的部分一般是5至7个高GC含量的核苷酸，襻的部分是15至30个可以与PCR模板互补的核苷酸序列，而且探针的5`-端和3`-端分别标记有荧光报告基团和淬灭基团(由于这两个基团处于茎的结构中，靠得很近，没有荧光信号产生，在PCR每一个循环的变性过程中，处于茎襻结构的探针被打开，并在退火过程中与模板结合，使报告基因远离淬灭基团并释放荧光信号，因而荧光强度与被扩增的模板量成正比)。

无论哪种方法，每一轮循环中PCR的产出量都以荧光信号的形式被PCR仪的光学检测系统记录下来，在某一循环中荧光信号的强度达到预先设定的阈值时，此时的循环书称为CT(Threshold Cycle)，CT值与起始的模板量成反比(起始的PCR模板量越多，达到阈值的循环数即CT值越小)。如果要确定量的话，需要做出标准曲线，以CT值为纵坐标，起始模板数为横坐标作图。

常规PCR的产物在理论上呈指数级增长，而在实际反应中，由于底物浓度、酶活性等条件的变化，在循环数不断增加时，反应进入平台期，PCR产物不再呈指数级增长。荧光实时定量PCR的优点在于它避免了常规PCR的平台效应对起始模板量和最终产物量之间相关性的干扰。它的另一个优点是只有正确的扩增产物才能和用于定量的探针结合并产生荧光信号，这杨就避免了假阳性污染，对于临床诊断等工作特别有效。

外部链接

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